集成化在线样品预处理技术及在血浆内烟气多种代谢物分析中的应用

The complex constitutes, large concentration dynamic range of tobacoo smoke metabolites and fluid matrix disturbance are the key limited factors in the development of tobacoo smoke metabolic mechanism research. This project aims to improve the throughput and sensitivity of metabolites in plasma sample during smoke biomarkers systematic analysis. The following research works are intended to be performed: (1) Develop β-glucuronidase immobibized enzyme reactors(IMER) to realize the metabolites hydrolysis with high efficiency and high recovery; (2) Establish an integrated platform with the combination of IMER with mix cation exchange solid phase extraction, C18 solid phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry to improve the throughput and sensitivity of metabolite biomarkers analysis. (3) Applied the platform for online analysis of cotinine and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl) -1-butanol metabolites in plasma. The project not only provides a new idea for metabolites systematic research, but also holds great values for evaluation of harmful ingredients effects on human health.

生物体内烟气代谢物组成复杂、浓度差异大、体液基质干扰严重是制约烟气成分体内代谢机制研究的重要影响因素。本项目针对目前血浆内烟气代谢标记物系统研究面临的分析通量低、灵敏度低的瓶颈问题，拟开展以下几个方面的研究工作：（1）研制β-葡萄糖醛酸酶固定化酶反应器，实现血浆中目标代谢物的高效、高回收率水解；（2）构建集酶反应器、混合型阳离子交换固相萃取、C18固相萃取、液相色谱-质谱一体化的在线样品预处理代谢组学分析平台，提高代谢标记物的分析通量与灵敏度；（3）将技术平台应用于血浆中可天宁与4-甲基亚硝胺-1-（3-吡啶）-1-丁醇两类代谢物的分析，以期实现血浆内烟气多种代谢标记物高通量、高灵敏在线同时分析。本项目发展的集成化在线样品预处理技术不仅为烟气有害成分代谢标记物的系统研究提供了新思路，而且在评估其对人体健康的影响方面具有很强的应用价值。

本项目制备了基于有机聚合物整体基质的β-葡萄糖醛酸酶反应器，采用扫描电镜、红外、热重等方法对其形貌、状态、功能基团、热稳定性及酶活进行了表征，结果表明整体柱内部结构均匀、具有大孔结构，热稳定性好，所制备的固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器具有较好的活性。采用溶胶-凝胶法，以丙烯酰胺作为单体，制备了有机-硅胶杂化整体柱基质材料，通过优化硅酸甲酯（TMOS）和γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）两种单体的摩尔比值、功能单体丙烯酰胺和致孔剂聚乙二醇用量以及水浴温度等制备条件，获得了孔隙均匀，通透性良好，机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱；将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在上述整体柱上，以4-甲基亚硝铵基-1-（3-吡啶）-1-丁醇（NNAL）的O型糖苷化合物（NNAL-O-Gluc）与可替宁O型糖苷化合物（Cotinine-O-Glu）为底物研究了酶反应器的水解效果，证明酶反应器在短时间内可以同时实现多种O型糖苷化合物的高效水解，并将其应用于血浆、尿液等复杂样品体系中，解决了目前烟气代谢物分析前处理水解耗时长、效率低等问题。将酶反应器与纳升级液质（NanoLC-MS/MS）串联，构建了烟气代谢物在线水解预处理平台，50 min内能够同时实现烟气代谢物中NNAL与可替宁O型糖苷化合物在线水解以及高灵敏、高通量在线快速分析，为系统研究部分烟气成分在人体内代谢机制，并进一步阐明其对人体健康危害提供重要的技术支撑和分析工具。发表SCI论文2篇，中文核心3篇，申请专利6件，国际会议论文2篇，国内会议论文3篇，协助培养硕士研究生2名。