(p)ppGpp负调控胸膜肺炎放线杆菌形成持留菌的分子机制研究

The persisters are cells that have entered a state of low metabolic activity, here referred to as dormant or slow-growing cells under antibiotics treatment, it may contribute significantly to the biofilm formation and the failure to treat chronic infections. In our early research, we found the Actinobacillus pleuropneumoniae can form persister cells. The relA mutant had 30 times higher than the wild-type strain in the ability of forming persister cells. At the same time, the ability of form biofilm and resistant to antibiotics was increased. It was different from the phenomenon that had been reported in the E.coli. So, we speculated that it may have some new mechanism. Thus, we try to explore how the (p)ppGpp influence the persister cells of Actinobacillus pleuropneumoniae under different physiological state and pressure. We prepared to identify the genes that are related to the persister cells formation. And then, we want to discovered some new genes and proteins by the omics method. They may play important role when the wild-type strain entering the persistence and switching back to a growing state. These results would be the foundation for clarify the mechanism of persister cells from a new perspective, and provide powerful reference to solve the problem of bacterial chronic infection.

持留菌能够在遗传物质不变的前提下表现抗生素耐受特性，它与生物被膜形成，以及慢性感染的顽固性密切相关。前期研究表明，胸膜肺炎放线杆菌具有形成持留菌的能力。与野生型相比(p)ppGpp缺失株形成持留菌的能力增强30倍、形成生物膜及对多种抗生素的耐受能力增强，这与之前已报道的(p)ppGpp的缺失使大肠杆菌形成持留菌的能力降低现象截然相反，提示(p)ppGpp调控不同病原菌形成持留菌过程可能存在差异，但具体机制尚未阐明。因此本研究拟通过基因敲除及组学方法从所观察到的差异现象出发，进一步深入分析(p)ppGpp在不同生理状态及压力下对胸膜肺炎放线杆菌形成持留菌的影响，同时对可能参与调控的相关蛋白进行功能验证，并鉴定持留菌形成及恢复过程中参与的新基因及新蛋白。研究结果将为从一个全新的角度解读持留菌的形成机制奠定基础，为揭示细菌慢性感染机制提供有力的参考。

持留菌能够在遗传物质不变的前提下表现抗生素耐受特性，它与生物被膜形成，以及慢性感染的顽固性密切相关。前期研究表明，胸膜肺炎放线杆菌具有形成持留菌的能力。与野生型相比(p)ppGpp缺失株形成持留菌的能力增强30倍、形成生物膜及对多种抗生素的耐受能力增强 ，这与之前已报道的(p)ppGpp的缺失使大肠杆菌形成持留菌的能力降低现象截然相反，提示(p)ppGpp调控不同病原菌形成持留菌过程可能存在差异，但具体机制尚未阐明。本项目通过构建双基因敲除突变体，比较了野生型与突变体在不同营养状态及压力下的生理生化特性及形成持留菌能力，结果表明小分子ppGpp可以改变氟苯尼考处理条件下野生型菌株的持留菌形成能力，在对数生长期内，由于突变体缺乏小分子ppGpp的调控作用，表现出对抗生素的耐受能力增强；但是随着时间的延长，由于突变体在缺失小分子ppGpp合成能力后的生长能力减弱，又表现出存活菌量迅速降低的趋势。小分子ppGpp缺失导致菌株毒力和存活能力下降。电镜观察结果表明，突变体随着培养时间的延长菌体逐渐拉长，分裂间隔数量减少，而野生型两种现象均不明显。通过转录组学方法从差异表达基因中鉴定到上调表达的基因多与嘌呤代谢途径相关，下调表达基因多与抗氧化途径相关，两种途径均与胸膜肺炎放线杆菌生长密切相关，证明了小分子(p)ppGpp可以通过调节嘌呤代谢途径中相关酶的表达，改变体内GTP含量，进而调节H2O2含量，影响胸膜肺炎放线杆菌的生长，同时，(p)ppGpp的互作蛋白（MnmE）是否在调节翻译过程中起到重要作用，并间接影响持留菌的形成仍需进一步验证，这些工作为揭示细菌慢性感染机制提供有力的参考。截止目前，研究工作基本完成并取得一定进展，同时为后续工作开展奠定基础。