PhoBR双组份调控系统对胸膜肺炎放线杆菌致病性调控机制研究

胸膜肺炎放线杆菌（APP）是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。了解双组分调控系统调控APP致病性机制对于防治疾病具有重要意义。本实验室已完成我国流行的APP血清3型JL03菌株全基因组测序，预测了APP具有5对双组份调控系统，对其中一对双组分调控系统PhoBR缺失后开展致病性试验，发现PhoBR与致病相关，但PhoBR调控致病性机制尚未清楚。因此，本项目拟以PhoBR为研究对象，进一步构建PhoBR单基因突变株，通过基因芯片、双向电泳及生物信息学，筛选毒力相关差异表达基因并通过real-time RT-PCR、Western blotting验证。利用EMSA、5'-RACE、DNase I足迹实验和SPR仪鉴定PhoB直接调控基因及调控靶序列和结合位点，进一步对直接调控基因缺失后进行致病性分析。通过以上研究，阐明PhoBR对APP致病性影响的调控机制，为APP新型疫苗研制奠定基础。

双组份调控系统（TCS）具有参与调控细菌致病性、生长代谢、耐药性、毒力因子表达等多种重要生物学功能。大量研究表明：病原菌PhoBR双组份转导系统在磷限制培养条件下，PhoBR 参与调控磷、糖的代谢和相关毒力因子的表达，但当前未见PhoBR在猪传染性胸膜肺炎中调控致病机制的研究。本项目利用蔗糖浮负向筛选技术，选用APP血清1型强毒力菌株SLW01作为亲本菌株，构建了SLW01的双基因缺失突变株ΔphoBR和互补菌株CΔphoBR。.突变株∆phoBR生物学特性研究结果表明：ΔphoBR在体外可稳定遗传；在正常培养条件下，突变株∆phoBR体外增殖能力相比较野生株生长速率明显变慢，活菌数下降；而在磷限制培养条件下，突变株∆phoBR体外增殖能力与野生株SLW01基本一致。.小鼠半数致死量（LD50）结果表明：突变株∆phoBR相比于亲本株SLW01和互补菌株CΔphoBR毒力分别上升1.73倍和2.05倍。小鼠存活率实验表明：相同感染剂量，突变株∆phoBR组14只仅存活一只，存活率为7.14%。亲本株SLW01组最终14只存活6只，存活率42.86%，毒力差异显著；小鼠载菌量实验表明：在入侵与感染初期，突变株ΔphoB/R肺与血液中的载菌量显著高于野生株SLW01。随着感染时间的延长至120h，两者在肺组织中的菌量基本趋于一致，而在血液中的突变株的载菌量还维持在一个较高的水平；中性粒细胞杀伤实验表明，突变株ΔphoBR抵抗PMN杀伤能力相比于亲本株SLW01增强，差异极显著。以上结果表明，突变株ΔphoBR毒力相比于亲本株毒力上升。.表达谱芯片结果显示，在正常培养条件下，突变株∆phoBR相比于亲本株SLW01上调表达2倍以上基因5个下调表达基因7个，这12个基因主要与糖类转运代谢先关；在磷限制培养条件下，突变株∆phoBR相比于野生株SLW01上调表达2倍以上基因119个，下调表达2倍以上基因60个。进一步通过荧光定量PCR试验证实芯片结果可靠。.EMSA试验证实：clpB蛋白酶基因受phoBR直接调控。通过以上研究，阐明phoBR通过调控clpB来影响APP毒力和致病性的分子机制，为APP新型基因疫苗的研制和新药靶标筛选提供了新的思路和重要材料。项目发表相关论文13篇，其中SCI收录12篇，获得湖北省科技进步一等奖1项。培养毕业研究生4名，在读硕士2名。