YAP癌基因在乙肝病毒X蛋白致癌中的作用及其分子机制的研究

Infection of hepatitis B virus (HBV) plays a crucial role in the development of hepatocellular carcinoma(HCC). Our previous studies indicated that hepatitis B virus X protein (HBx) contributed to the hepatocellular carcinogenesis. However, the molecular mechanism remains unclear. Our group has been engaged in the mechanisms of the HBx involved in the hepatocarcinogenesis and published many papers. Based on our preliminary studies, we will further explore the role of YAP in hepatocarcinogenesis mediated by HBx.The main contents of this project are shown as follows: (1) using molecular biology techniques, systematically demonstrate the regulation of YAP mediated by HBx at the levels of molecule, cell and animal, combined with the application of HBx transgenic mice, and the clinical surgery of fresh HCC tissues; (2) investigate the role of YAP involved in cell proliferation and migration induced by HBx using MTT, colony formation, animal transplantation, wound healing assay and transwell analysis; (3) elucidate the molecular mechanism by which HBx up-regulates YAP involved in promotion of cell proliferation and migration through epigenetic, transcription factors, microRNAs and YAP signaling pathway network. This study will provide new insights into the hepatocarcinogenesis mediated by HBx. It will provide the new target in therapy of HCC.

乙肝病毒（HBV）的感染与肝癌的发生发展具有十分密切的关系。研究结果表明乙肝病毒X蛋白（HBx）具有致癌作用，但其致癌的分子机制迄今不清。本课题组长期从事乙肝病毒X蛋白致癌分子机制的研究，发表了多篇相关论文，有很好的研究基础，初步研究结果发现HBx 对癌基因YAP具有调节作用。本项目将在前期研究基础上进一步深入探讨HBx 对癌基因YAP的调节作用，并阐明其分子机制，主要研究内容有：应用分子生物学手段在分子、细胞、转基因鼠、动物和临床标本等层面详细研究X蛋白对YAP的调节作用；通过MTT、克隆形成、动物成瘤、细胞划痕和transwell等实验，观察YAP在HBx促进肝癌细胞增殖和迁移中的作用；通过表观遗传、转录因子、microRNA及其YAP信号通路网络的影响，重点阐明HBx调节YAP促肝癌细胞增殖及迁移的分子机制。该研究将进一步丰富乙肝X蛋白致癌的分子机制，为预防和治疗肝癌提供新的靶点。

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是常见的恶性肿瘤之一。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）慢性感染与肝癌的发生发展具有十分密切的关系，乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein, HBx）通过多种途径促进肝癌的发生发展，但其致癌的分子机制迄今尚不十分清楚。癌基因Yes-associated protein（YAP）作为新发现的Hippo信号通路的主要效应因子，在调控细胞增殖与凋亡、控制器官大小、细胞接触性抑制丧失乃至肿瘤的发生发展方面起着重要作用。本项目从癌基因入手，深入探讨HBx通过上调YAP癌基因促进肝癌细胞增殖的作用及其分子机制：首先我们应用免疫组化检测了肝癌组织芯片中YAP的表达情况，应用实时定量PCR检测了33例临床肝癌组织中YAP和HBx的mRNA表达水平。研究结果显示，YAP在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁肝组织，其表达水平与HBx的表达水平呈显著正相关。然后，应用实时定量PCR和Western blot发现在HBx转基因鼠和肝癌细胞系（HepG2.2.15，HepG2-X，H7402-X）中YAP的表达均被HBx上调。肝癌细胞系（HepG2.2.15，HepG2-X，H7402-X）中转染HBx RNAi后YAP的表达均被下调，上述结果显示HBx可以上调YAP的表达。接着我们对HBx上调YAP的分子机制进行了研究。应用双荧光报告基因检测，发现HBx可以激活YAP的核心启动子。应用染色质免疫共沉淀和EMSA实验检测，发现HBx可通过CREB间接结合到YAP的启动子上，进而上调YAP的表达。应用MTT检测、EdU掺入实验和克隆形成等实验方法，发现在肝癌细胞转染YAP RNAi后，肝癌细胞的增殖受到抑制；裸鼠成瘤实验结果显示，转染YAP RNAi后肝癌细胞HepG2-X的成瘤能力明显下降。本研究发现HBx通过结合CREB激活YAP启动子并上调其表达，促进肝癌细胞增殖。综上所述，本研究发现HBx通过调节癌基因YAP促进肝癌的发生发展，进一步丰富了HBx促进肝癌细胞增殖的分子机理研究，对肝癌的早期诊断、预防和治疗具有重要的理论意义和实际应用价值。