miR-429靶向调节NF-κB信号通路调控人神经母细胞瘤增殖和转移机制的研究

Malignant transformation of nonresolving inflammation is an important factor in tumor development, studies have shown that the activation of NF-κB pathway is important to neuroblastoma proliferation and metastasis, many factors, including the miRNA involved in the regulation. So far, the mechanism of the effect of miRNA regulated NF-κB on the proliferation and metastasis of neuroblastoma is still poorly understood. Our pre-test showed that miR-429 promoted the proliferation of neuroblastoma, and the target gene is IKKβ. Accordingly, we propose the hypothesis: miR-429 targeting regulated IKKβ ,and IκB inactivating phosphorylation in NF-κB pathway effect the proliferation and metastasis of neuroblastoma. To test this hypothesis, we using RT-PCR, Western Blot and constructs overexpression vector to detect human neuroblastoma cells and tissue, probing the mechanism of the effect of miR-429 targeting regulated NF-κB pathway on proliferation and metastasis of neuroblastoma from the molecular, cellular and tissue levels. This study will reveal the foundation of the proliferation and metastasis of neuroblastoma from this new viewpoint, and will provide new ideas for researching new targeting drugs for neuroblastoma.

非可控性炎症的恶性转化是肿瘤发生发展的重要因素之一， 研究表明，NF-κB通路的激活是神经母细胞瘤增殖和转移的重要路径，miRNA分子在内的众多因子参与通路的调节。迄今，miRNA调节NF-κB通路调控神经母细胞瘤的增殖和转移的机制仍知之甚少。我们预实验表明miR-429能促进神经母细胞瘤的增殖，证实其靶基因为IKKβ。据此，我们提出假说：miR-429通过调节靶基因IKKβ，使IκB磷酸化失活而调控NF-κB通路，进而影响神经母细胞瘤的增殖和转移。为验证这一假说，我们将通过人神经母细胞瘤细胞及肿瘤组织，采用RT-PCR、Western Blot和构建过表达载体等方法，从分子、细胞和组织水平探讨miR-429调节NF-κB通路调控神经母细胞瘤增殖和转移中的重要作用及其作用机制。本研究将从这个新视点为揭示神经母细胞瘤的增殖和转移机制奠定基础，为神经母细胞瘤的靶向药物治疗研究提供新的思路。

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是小儿最常见的恶性实体肿瘤之一，恶性程度高，60%的患儿发生骨髓转移，尽管对NB患儿采取手术等综合治疗，生存率也仅有40%，被称为难治多变的“儿童癌症之王”。至今尚未完全阐明NB发生、发展、侵袭及转移的机制。因此，探明NB发生、增殖、侵袭和转移的机制，寻找可能的干预方法，对挽救NB患儿的生命具有重要意义。为此，本课题进行了miR-429通过调控NF-κB通路对NB细胞增殖、转移和侵袭的影响的研究。首先，提取10例NB组织标本中的总RNA进行RT-PCR，检测miR-429的表达水平；然后，选取SK-N-SH 和SH-SY5Y细胞系作为研究对象，通过转染miR-429 mimics过表达miR-429 和转染miR-429 ASO抑制miR-429的表达后，应用细胞毒性实验、克隆形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和细胞凋亡实验验证转染后对NB的增殖、转移和侵袭的影响；预测并验证IKKβ为miR-429的靶基因，进一步验证NF-κB及IKKβ对NB增殖、转移和侵袭的影响。结果表明，NB组织中miR-429表达明显低于正常水平，提示miR-429在神经母细胞瘤的发生发展中起着重要作用；转染miR-429 mimics后，miR-429表达显著增强，克隆形成实验等显示NB细胞增殖明显受抑制，侵袭和划痕实验显示，NB细胞迁移和侵袭能力降低，流式细胞术分析，转染后，NB细胞凋亡率升高，以上结果表明，miR-429能够抑制NB细胞的增殖、迁移和侵袭；抑制miR-429表达后，miR-429的表达明显降低，克隆形成实验等显示，NB细胞增殖增加，侵袭和划痕实验显示，NB细胞侵袭能力增强，流式细胞术显示，NB细胞凋亡受抑制，以上结果表明，miR-429能够抑制NB细胞的增殖、迁移和侵袭；软件预测并证实在NB细胞中IKKβ是miR-429的靶基因，过表达miR-429后，3个NF-κB的靶基因的mRNA表达显著降低，MTT实验表明，过表达IKKβ能显著减弱NB细胞中miR-429的抑制效果，表明miR-429通过以IKKβ为靶点发挥抑制NB细胞增殖的作用。总体结果表明，NB中IKKβ在miR-429 调节的NF-κB通路中扮演重要的角色。miR-429调控的NF-κB通路可能作为潜在的NB治疗靶点，为进一步临床转化研究奠定了基础。