基于超高分辨率显微成像技术的程序性细胞坏死机制研究

Necrosis plays a critical role in inflammation and host defense. RIP1-RIP3-MLKL axis was recently identified as a key signaling pathway of cell necroptosis. These three proteins form complex called necrosome during the course of necroptosis, but how they assemble to form necrosome is still largely unknown. Our preliminary study showed that RIP1, RIP3 and MLKL containing necrosome localize in cytoplasm as puncta and is not associated with any organelles. Since the assembling of necrosome is essential for necroptotic signal, we have set up a super-resolution microscope (STORM) with an image resolution of about 20 nanometers in the lateral dimensions and about 60 nanometers in the axial dimension to study the assembling and dynamic changes of necrosome. Based on this approach, we intend to obtain the precise spatial information of necrosome and detemine the influence of necrosis inhibitor and phosphorylation of RIP3 and MLKL on complex assembly. This study should obtain structural and regulatory information of necrosome at nanometer level, which will significantly improve our understanding of the regulation of cell necroptosis.

细胞坏死在炎症反应，宿主防御等方面发挥重要作用。近期研究揭示了以RIP1-RIP3-MLKL为轴心的程序性细胞坏死信号通路，但目前还不清楚该信号通路核心复合物（necrosome）的组装过程。本项目拟在HeLa和L929细胞中重建表达necrosome关键成员（RIP1,RIP3,MLKL），利用STORM超高分辨率显微成像技术研究程序性细胞坏死过程中不断生长的necrosome。前期数据表明necrosome与所有的细胞器没有明显关联，提示该复合物有其独特的胞质定位。由于necrosome的组装是程序性细胞坏死信号的关键调控步骤，借助STORM平面约20 nm，轴向约60 nm的图像分辨率，我们将进一步获取necrosome的精确空间信息并确定坏死抑制剂和磷酸化在复合物组装中发挥的调节作用。我们的研究将会得到necrosome纳米水平的结构信息，提高人们对程序性细胞坏死调节机制的认识。

生物分子的空间分布和动态变化能为我们理解多种生物过程中发生的信号转导提供至关重要的信息。为了解决常规光学显微镜分辨率受限的问题，我们搭建了最新的超高分辨率显微成像平台（STORM），并成功实现平面20 nm和轴向60 nm的效果。我们采用该技术实现了对于细胞坏死小体的精细解析：1）复合物成员（RIP1、RIP3和MLKL）在细胞浆中形成点状分布，并且不与任何检测的已知细胞器共定位；2）超高分辨率显微成像揭示坏死小体的复杂空间组织，并且与细胞死亡进程密切相关；3）坏死细胞中发生大量的RIP3和MLKL磷酸化，但该修饰方式对于坏死小体的形成不是必须的。我们的结果在纳米尺度上阐明了未知的坏死小体空间组织结构，对于我们更好的理解和调控细胞坏死具有重要的意义。另外，为了拓展超高分辨显微成像在生物学研究中的应用，我们开发了一个具有更高亮度，更强稳定性的溶酶体STORM探针。它的出现将会进一步帮助我们实现多种病理相关的溶酶体超高分辨成像。综上，我们完成了申请书所规定的全部任务，利用本基金资助我们已发表1篇论文，另有1篇论文正在整理投稿中，超额完成了我们的研究计划。