基于二维亲和超滤色谱的金钱草中醛糖还原酶抑制成分的筛选及其活性研究

Aldose reductase inhibitor is the ideal drug for the treatment of diabetic complications due to aldose reductase is the enzyme critically involved in the onset and progression of various pathologies associated with diabetic complications. The research work of identification and characterization of aldose reductase inhibitors from natural origin is significative and valuable. To understand the composition of Lysimachia christinae Hance responsible for aldose reductase inhibition and improve the screening efficiency of aldose reductase inhibitors from natural origin, the approach of two-dimensional affinity-based ultrafiltration chromatography is developed in the present project. First, the high-speed countercurrent chromatography will be applied which allows the fractionation of principal components and enrichment of minor concentrated components from extract; then, the non-covalent interactions of aldose reductase and its inhibitors will be investigated using ultrafiltration-liquid chromatography/mass spectrometry; according to these results, the high efficient novel aldose reductase inhibitors will be screened and isolated by ultrafiltration-liquid chromatography/mass spectrometry; finally, the structures, aldose reductase inhibitory activities, inhibitory selectivity, and inhibitory mechanism of the isolated compounds will be studied and assessed. This project aims to provide the creative thinking and method for developing natural aldose reductase inhibitor drugs, and provide the theoretical basis for further utilizing the resource of Lysimachia christinae Hance in our country.

醛糖还原酶（AR）作为糖尿病并发症药物开发的关键靶点，其抑制剂（ARI）是治疗糖尿病并发症的理想药物，因此天然来源ARI的筛选、活性评价及作用机制的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。为了明确金钱草对AR抑制作用的物质基础，提高新颖高效的天然ARI筛选效率，本项目将首次建立并使用二维亲和超滤色谱法。首先使用高速逆流色谱分馏金钱草的主要成分并富集微量成分，制备一维层相；其次，以亲和超滤-液质联用的方法为手段，系统的研究AR和ARI之间的非共价作用关系及规律；然后，以上述研究结果为基础，建立二维亲和超滤色谱快速筛选、分离和鉴定金钱草一维层相中新颖高效的ARI；最后利用光谱技术对ARI结构解析，并从分子水平上评价其对AR抑制的活性和选择性，阐明其抑制机理，为我国金钱草资源的进一步开发利用提供理论依据，也为开发新型高效的天然ARI药物治疗糖尿病并发症提供创新的研究思路和方法。

醛糖还原酶（AR）作为糖尿病并发症药物开发的关键靶点，其抑制剂（ARI）是治疗糖尿病并发症的理想药物，但由于现有药物的副作用大，严重限制了其临床使用，迫切需要开发新的更安全有效ARI，因此天然来源ARI的筛选、活性评价及作用机制的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。本项目以高糖诱导视网膜血管病变的转基因斑马鱼胚胎Tg(fli1:EGFP)为实验动物模型，初步证实了中药金钱草具有体内AR抑制活性，具有改善糖尿病性视网膜病变血管增生的潜力。为了明确金钱草对AR抑制作用的物质基础，提高新颖高效的天然ARI筛选效率，本项目建立并使用了基于高速逆流色谱-亲和超滤-液质联用技术的二维亲和超滤色谱法。首先，以正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，采用了梯度洗脱分离模式，利用高速逆流色谱分馏了高含量代谢物，循环富集了微量代谢物，制备了金钱草活性部位的一维层相；其次，以亲和超滤-液质联用的方法为手段，总结了AR和ARI之间的非共价作用关系及规律，构建了基于亲和超滤-液质联用技术的复杂混合体系中小分子与生物大分子结合亲和力的直接测定新方法；然后，以上述研究结果为基础，利用二维亲和超滤色谱快速筛选和初步鉴定了金钱草一维层相中的223种ARI，其中黄酮类衍生物60种，萜类衍生物20种，酚酸类衍生物19种，香豆素类衍生物7种。本项目的研究结果为我国金钱草资源的进一步开发利用提供理论依据，也为开发新型高效的天然ARI药物治疗糖尿病并发症提供创新的研究思路和方法。