基于二维整体亲和色谱的天然TDP2抑制剂的快速筛选及其活性评价

To reverse multidrug resistances(MDR) has been one of the important strategies in tumor treatment. The existing reversal agents for Top2 poisons designed by inhibiting the activity of membrane transporter protein are limited by severe side effects in clinic. Hence, it is urgent to search for safe and effective resistance reversal agents. On the basis of previous work on preparation of immobilized enzyme affinity column, this project aims to screen active constituents for TDP2 inhibition from five commonly used herbs by preparing capillary monolithic TDP2 affinity column and constructing two dimensional monolithic affinity chromatography(MAC)-nanoLC-MS/MS system. The activities of the screened compounds are verified by enzyme activity assay and tumor cell proliferation inhibition and chemotherapy sensitizer test. The inhibition mechanism is discovered by Lineweaver-Burk principle and binding sites are studied by molecular docking technology. In this project, the stable and robust monolithic affinity column is firstly designed to construct the on-line second dimensional MAC-nanoLC-MS/MS system, which provide a new approach for TDP2 inhibitors screening and new ideas for developing new tumor resistance reversal agents for Top2 poisons.

逆转肿瘤耐药性是肿瘤治疗的重要策略之一，基于膜转运蛋白活性抑制机制开发的拓扑异构酶2（Top2）毒剂肿瘤耐药逆转剂因毒副作用较大，临床应用受到了限制。因此，寻找高效、低毒的新型逆转剂成为肿瘤耐药研究的重要内容。在利用固定化酶进行药物筛选的前期工作基础上，本项目拟以TDP2为靶分子，以5种常用的抗肿瘤中药为研究对象，通过制备毛细管整体固定化TDP2亲和柱，构建二维整体亲和色谱-nLC-MS/MS系统筛选中药中TDP2抑制活性成分，从分子水平和细胞水平验证筛选出的活性成分的活性及其对化疗耐药细胞的增敏效果，根据酶学原理探讨其抑制机理，采用分子对接的方法研究活性成分与酶结合的位点。本研究首次制备固定化TDP2亲和柱，建立高效、快速的TDP2酶抑制剂筛选方法，如果课题成功实施和完成，将为中药TDP2抑制剂的筛选提供新技术，也为Top2毒剂肿瘤耐药逆转剂的开发提供新思路。

逆转肿瘤耐药性是肿瘤治疗的重要策略之一，基于膜转运蛋白活性抑制机制开发的拓扑异构酶2毒剂肿瘤耐药逆转剂因毒副作用较大，临床应用受到了限制。因此，寻找高效、低毒的新型逆转剂成为肿瘤耐药研究的重要内容。在前期成功地从中药中筛选到神经氨酸酶及芳香化酶抑制剂的工作基础上，本工作以酪氨酰-DNA磷酸二酯酶（TDP2）为靶分子，制备了两种固定化TDP2酶反应器。首先，在制得poly(GMA-Co-EDMA)整体柱后，利用纳米金的大比表面积，使酶通过共价键合作用固定在毛细管内，制得的整体酶反应器载酶量较多，但稳定性及重复性不佳。然后，我们利用氨丙基三乙氧硅烷试剂使毛细管带正电荷，利用戊二醛的桥连作用，通过共价键合作用将酶固定在毛细管内，制得开管固定化酶反应器，其稳定性及重复性都比整体固定化酶反应器要好很多，反应器制备方法简单，酶反应的效率高，重复反应次数可达60次以上；底物与产物在5min内分离，使其非常适合于中药活性成分的快速筛选。此外，我们还成功地建立了电泳介导微分析法，实现在毛细管内的酶的反应。本工作分别选取生物碱类抗肿瘤中药及其活性成分的标准品为研究对象，用开管固定化酶反应器筛选其活性成分，但是均未筛选到对TDP2酶有强抑制活性的成分。虽然预期目标并未实现，但本工作建立的酶反应器及高效、快速的筛选方法，为中药中酶抑制剂类活性成分的筛选提供了新的方法，也可用于虚拟筛选后的化合物活性的验证。在本项目的支持下，本工作也探索了液质联用技术在小分子分析中的应用。采用化学衍生化方法将短链脂肪酸衍生后，在正离子模式下，采用液质联用方法成功地实现了11个短链脂肪酸的分析，并将该方法成功地应用于艾滋病人血浆及尿液中短链脂肪酸的分析。