基于高通量细胞模型筛选猪二型食欲肽受体激动剂活性先导化合物的研究

Orexin receptor 2 (OX2R) belongs to G protein-coupled receptors and exerts its actions via two different agonists, namely orexin A and orexin B. Orexins are important signaling molecule and can regulate energy dynamic balance in animals. They have been implicated in feeding, energy homeostasis, neuroendocrine function, cardiovascular control, pain, and sleep-wake cycles. In order to identify lead compounds for porcine orexin-2 receptor (pOX2R) from natural products, an luciferase reporter gene screening model of pOX2R agonist will be established for high throughout screening. Firstly, we will clone porcine OX2R and then develop porcine OX2R/pcDNA3.1 mammalian expression vector construct and a luciferase reporter gene construct that can respond to Gs-, Gi-, and Gq-coupled receptors. The porcine OX2R/pcDNA3.1 and luciferase reporter gene plasmid will be cotransfected into HEK293 to establish stable cell lines for screening active compounds of porcine OX2R. Using these cell lines, over 200 extracts of natural products will be screened and we expect that some of them will be able to activate the porcine OX2R. The extracts from natural products might be identified as porcine OX2R agonists through isolation and purification. This work provides an alternative vision of how to use herb medicines and a new way to develop potential feed additives and drugs for growth promotion and disease control of animals.

二型食欲肽受体（Orexin receptor 2，OX2R）在动物的能量平衡中起重要调控作用，其激动剂具有促进食欲、提高生产效率、促进胃酸分泌等作用。因此，研究开发具有 OX2R激动剂活性的生长促进剂具有较大应用价值。本课题旨在通过建立基于荧光素酶报告基因检测的猪二型食欲肽受体激动剂高通量细胞筛选模型，从天然提取物库中获得具有猪OX2R激动剂活性的先导化合物。.首先，克隆猪OX2R基因并引入荧光素酶报告基因方法，检测配体通过受体对细胞内cAMP影响情况，以确认克隆所得受体具有生理学活性。其次，以猪OX2R基因和荧光素酶报告基因共转染获得稳定表达细胞株建立筛选模型。最后，运用该模型对多种天然产物提取物进行初筛，并对初筛产物进行活性成分分析。

食欲肽（Orexin）是由下丘脑食欲肽能神经元分泌的一类神经肽，它能够在大脑不同区域高效地表达，可对动物的能量平衡进行有效的调节。目前，虽然关于OX2R信号通路方面的研究已有报道，但在家畜方面的报道仍比较少，特别是猪，而猪的体重又是重要经济指标。本课题在猪OX2R真核表达质粒成功构建的基础上，以cAMP水平变化所建立的报告基因检测方法为依据，建立以猪OX2R为靶点的稳定、可靠的猪OX2R激动剂细胞筛选模型，对选取的部分中药的提取物进行筛选，用来发现一些其他非内源性的激动剂，为筛选提高猪的生产效率的先导化合物及相关药物的研发做一些基础性的研究。主要研究结果如下：.1、将猪OX2R真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R与荧光素酶报告基因质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]以1:5的比例共转染到CHO-K1细胞，通过G418和潮霉素B进行抗性筛选得到萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的一株单克隆株作为阳性细胞株；提取其总RNA，RT-PCR后在预期位置扩增出猪OX2R基因目的条带，同时，通过加Foskolin检测萤火虫荧光素酶表达量的变化，证实了萤火虫荧光素酶基因的成功转入。.2、将pcDNA3.1(+)空载体和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]荧光素酶报告基因质粒以1:5的比例按上述方法共转染CHO-K1细胞株，按1方法得到荧光素酶表达量最高且背景值较低的单克隆株作为阴性细胞株。同时，通过转染后加Foskolin检测萤火虫荧光素酶表达量的变化，证实了萤火虫荧光素酶基因的成功转入。.3、对所选阳性单克隆细胞筛选模型进行条件优化，发现当激动剂OXB终浓度为10-6mol/L，孵育时间为9h，溶剂DMSO终浓度小于等于3％及检测试剂Luciferase Assay Reagent用量为原液的1/2时，筛选模型Z因子值为0.85，说明建立的筛选方法可靠、稳定，可用于OX2R激动剂的筛选。.4、分别利用醇提法与水提法对18种天然中药进行有效成分提取，得到36种天然提取物样品，利用建立的猪OX2R稳定细胞株进行激动剂的筛选并利用阴性细胞株排除了假阳性天然提取物样品，得到本底比大于2的提取物样品共3种，其中醇提物2种，水提物1种；利用HEK293T细胞进行瞬时转染对得到的3种阳性提取物样品进行剂量效应关系的研究，发现在一定浓度范围内，3种提取