微粉化复方ANBP促愈抑瘢及诱导成纤维细胞重编程为表皮细胞的研究

Double efficacy of enhancing wound healing and inhibiting scar formation after wound is hot spot and difficulty in the field of regenerative medicine research. Early research has shown that: 1. The effect of Pulverized ANBP of Traditional Chinese Medicine Compounds to promote wound healing and suppress the scar in animal models is obvious. 2. The microenvironment changes after trauma can be induced differentiated mature myofibroblasts reprogramming of epidermal stem cells. Recent research shows that Ski genes associated with wound healing, to promote the dual effect, bidirectional regulating in different periods of TGF - beta/Smad through the dependent and independent pathway on Fb. Therefore, we put forward hypothesis " Pulverized compound ANBP can repair dermal three-dimensional structure, balance trauma local microenvironment, the normal repair genes, its mechanism through the bidirectional regulation TGF - beta pathways, inducing fibroblast epidermal cells reprogrammed to epidermalcyts to realize ". This project will be by FSP1 - iCreERT2 - GFP transgenic mice as the research object, using the endogenous tracing technology, mimicking skin embryonic development microenvironmental changes, screening the equilibrium status of local microenvironment and the optimal time point of dermal fibroblasts differentiation、transdifferentiation and programming to epidermal cells in the different periods after wound using ANBP effectively, which provides the theoretical basis to achieve scar-free healing after trauma and effective clinical interventions.

创伤后促愈抑瘢是再生医学领域研究的热点和难点。胚胎发育环境是胚胎无疤痕愈合的前提。前期研究表明：1. 微粉化复方ANBP 在动物模型中促愈抑瘢疗效明显；2.创伤后微环境变化可诱导已分化成熟的肌成纤维细胞重编程为表皮干细胞。新近研究表明：Ski是与创伤修复相关的基因，具促愈抑瘢双重疗效，在不同时期双向调节Fb的TGF-β／Smad依赖和非依赖性通路。因此，我们提出“微粉化复方ANBP可能通过双向调节TGF-β通路和ECM等途径，形成类似胚胎发育的最适微环境，促进修复基因适度表达，有效诱导创面Fb出现类似于皮肤胚胎发育不同时期重编程现象”的假说。本项目以FSP1-iCreERT2-GFP转基因小鼠为研究对象, 采用内源性示踪技术，证实微粉化复方ANBP干预后形成类似胚胎发育环境的最佳创伤微环境及真皮Fb重编程为表皮细胞，深入阐明其机理，为实现创伤后无疤痕愈合提供有效的临床干预手段和理论依据。

创伤高质量愈合是再生医学领域研究的热点和难点。前期研究表明：微粉化复方ANBP质量可控，是经典的治疗创伤的中药，通过促进肉芽形成，加速再表皮化达到促愈疗效，其机制与其双重调节TGF-β/Smad通路相关，有待进一步研究。为了从创伤微环境和细胞重编程角度深入阐明其细胞、分子水平机制，本项目开展了以下实验：1、采用形态学方法观察微粉化复方ANBP对小鼠皮肤创伤愈合作用；2、通过内在的示踪性分子标记构建 FSP1－iCreERT2－GFP 转基因小鼠背部全层皮肤缺损模型；3、用免疫荧光法检测FSP1－iCreERT2－GFP 转基因小鼠背部皮肤创伤修复过程及微粉化复方ANBP干预后，真皮Fb重编程的现象；4、采用生物信息学方法，利用蛋白质高通量技术(iTRAQ )，检测、分析创伤修复四个时期差异蛋白质分子的表达；5、用免疫组化法检测创伤修复ski基因，TGF-β/Smad信号通路的表达。结果显示：1、微粉化复方ANBP提高创面愈合率，加速创伤肉芽组织生长、促进再表皮化。2、空白组创缘、创面表皮Fb细胞在3d少量出现，7d大量出现，14d出现大量Fb细胞重编程为表皮干细胞现象；3、ANBP组在3d出现Fb细胞重编程为表皮干细胞现象，7d大量出现，14d表皮中Fb细胞消失、表皮及毛囊部出现表皮干细胞；4、定量全蛋白组学分析后， 共鉴定到3,171个蛋白质，其中3,164 个包含定量信息，以>1.5倍和<0.67为变化阈值，t-test p-value<0.05为标准，在定量到的蛋白质中，每组差异表达蛋白上调的分别是19 个、1 个、8个、37个，下调的分别是4 个,、 11个、28 个、 13 个；5、Ski的免疫组化结果显示：空白组从6h开始表达量逐渐升高，3d达到峰值，7d到14d逐渐降低；ANBP组从6h开始到14d表达量逐渐升高。与空白组比，ANBP组3d表达量较低，7d到14d，表达量较高，差异均具有统计学意义。结果表明：微粉化复方ANBP干预后通过形成最适创伤局部微环境，启动创伤修复ski基因，双向调节TGF-β/Smad信号通路，加速成纤维细胞重编程为表皮细胞进程，促进小鼠全层皮肤创伤愈合。本项目为实现创伤后无疤痕愈合提供理论依据和有效的临床干预手段。