系统学指导的放线菌万古霉素类化合物的快速筛选与发现

Vancomycin group compounds belong to the glycopeptide class of antibiotics, which are effective in the treatment of Gram-positive bacterial infections, and more importantly, it is useful in the treatment of clinically resistant Staphylococcus aureus. Vancomycin group antibiotics are synthesized by non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) in actinomycetes, and their gene clusters have special principles of phylogentic evolution. In this research, phylogenetic analysis of six published gene clusters of vancomycin group will be conducted to reveal the evolutionary mode of enzyme genes for main skeleton synthesis and tailoring enzyme genes. A link of evolutionary relation of these genes and their product structures is expected to be established, which would provide a theoretical basis for the genetic screening of vancomycin group compounds in actinomycetes. Appropriate genes will be chosen,according to the results of phylogenetic analysis above,as genetic markers of vancomycin group NPRS for screening. A model of genetic screening of vancomycin group antibiotics in actinomycetes will be build based on level of main skeleton synthesis and post tailoring. Thousands of actinomycetes strains wil be screened by this model, and further study will be done for some valuable vancomycin group compounds we found, such as bioactivity and toxicity assessment, pharmacological metabolism. The NRPS gene cluster will be cloned.

放线菌是天然活性产物最重要的微生物来源，万古霉素类化合物是由放线菌非核糖体多肽合成酶（Non-Ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）催化合成的一类糖肽类抗生素，具有广谱的抗革兰氏阳性菌活性，尤其抗临床耐药菌，因而有极其重要的临床药用价值。万古霉素类NRPS基因簇具有其特别的进化规律，本项目将对已发表的6个万古霉素类NRPS基因簇序列作系统发育分析，研究主结构合成酶基因和后期修饰酶基因的系统进化方式，阐明与相应产物结构之间的相关性，为放线菌万古霉素类化合物的筛选研究提供理论依据；根据系统发育分析结果选择合适的基因作为标记基因，从主结构合成和后期修饰两个层次上构建万古霉素类化合物的最佳基因筛选模型，为放线菌万古霉素类化合物的筛选提供快速有效的方法；对筛选出来的有价值的万古霉素类产物，进行活性、毒理、药理代谢方面研究，并进一步作生物合成基因簇的克隆研究。

放线菌是天然活性产物最重要的微生物来源，万古霉素类化合物是由放线菌非核糖体多肽合成酶（Non-Ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）催化合成的一类糖肽类抗生素，具有广谱的抗革兰氏阳性菌活性，尤其抗临床耐药菌，因而有极其重要的临床药用价值。万古霉素类NRPS基因簇具有其特别的进化规律，本项目对已发表的7个万古霉素类NRPS基因簇序列做了系统发育分析，研究主结构合成酶基因和后期修饰酶基因的系统进化方式，根据其与相应产物结构之间的相关性，选择了主结构合成酶基因C2结构域和卤化酶基因作为基因筛选的标记基因，构建并优化了万古霉素类化合物的基因筛选模型，为放线菌万古霉素类化合物的筛选提供快速有效的方法。以该筛选模型对中国药用微生物菌种保藏管理中心保藏的约2400株放线菌以及5株报道已知产物的参照菌株进行了PCR筛选及验证，筛选到5株具有抗菌活性的阳性菌株。对这5株阳性菌株和报道产II型产物avoparcin的菌株DSM 44225发酵液进行了LC-MS分析。菌株DSM 44225发酵液中检测到两个活性产物精确分子量为别为1941.56964和1907.59476，与β-avoparcin和α-avoparcin一致。阳性菌株CPCC 203689经相关序列系统发育分析，预测其产物为III型，其发酵液中检测到一个活性产物精确分子量为1952.5854，与已知的III型万古霉素类化合物actaplanin B1一致。阳性菌株CPCC 203688经相关序列系统发育分析，预测其产物为I型，其发酵液中检测到一个活性产物精确分子量为1242.3535，经查Scifinder暂无已知相关化合物与之匹配，随后进行了放大发酵及产物分离制备。CPCC 203688大量发酵产物经过分离纯化得到了一系列的万古霉素类化合物，对其中5个积累到足够量的化合物做了质谱及核磁共振波谱分析，鉴定了其化学平面结构，确定这5个化合物为新化合物，是已知I型万古霉素类抗生素OA-7653的新结构类似物。新化合物294W1进行了革兰氏阴性菌抗菌谱测定和人肾小管上皮细胞(HKC)细胞毒性测试，结果表明294W1的抗菌活性和细胞毒性与临床用药万古霉素没有突出之处。CPCC 203688做了全基因组测序，并分析了其万古霉素类产物生物合成基因簇，目前正在做相关基因的敲除实验。