基因筛选指导海洋细菌抗病原真菌新型先导化合物的发现

海洋细菌（包括放线菌）是新型生物农药的重要来源，然而随着微生物资源的不断开发和重复筛选，发现新化合物的几率不断下降。为了定向筛选和高效发现新型抗植物病原真菌先导化合物，本项目以海洋细菌及其基因和代谢产物资源为研究对象，对有较强抗植物病原真菌活性海洋细菌，进行PKS、NRPS、Halogenase、KR基因的PCR筛选、AFLP和/或DGGE基因分型、DNA序列测定和比对，以及生物信息学预测化合物结构类型，定向筛选一批产生新型活性代谢产物的海洋细菌；优选其中2株以上，使用固相萃取、HPLC、MS和NMR等技术，对其抗真菌产物进行提取、分离和鉴定，发现3～8个新的先导化合物。这是首次尝试采用功能基因筛选指导的方法定向筛选产新型抗植物病原真菌活性物质的海洋细菌资源，该项目的实施也将为其他新型先导化合物的定向发现提供研究思路，并为研发我国自主知识产权的新型海洋微生物杀菌剂奠定基础。

随着病原微生物耐药性日益严重和环境污染问题不断恶化，新型生物杀菌剂的需求越来越大。海洋微生物是新型生物农药的重要来源。然而随着微生物资源的不断开发和重复筛选，发现新化合物的几率不断下降。因此，本项目以去重复化后海洋细菌（包括放线菌）为研究对象，通过整合生物和化学筛选的方法（基因筛选-活性筛选-化学筛选）系统的建立了能高效获得新型活性先导化合物的新途径。.本项目从分离获得的900多株海洋微生物资源，通过形态学、酶学特征以及系统进化树分析获得超过80株高质量、去重复的海洋细菌资源，对部分菌种的PKS I、PKS II、NRPS和Halo基因进行了PCR筛选和生物信息学分析，发现15株具有产新型生物活性产物的潜力。进一步采用OSMAC策略发酵、完成其提取物的活性筛选。并通过HPLC指纹图谱研究其化学多样性，结合提取物产量，确定其发酵条件。最后采用多种色谱手段对优选微生物的活性次生代谢产物进行了分离，并利用NMR、质谱等波谱方法确定了它们的化学结构。从优选的异壁放线菌SHA6分离和鉴定3个新的具有抑制病原真菌活性的次生代谢产物，分别命名为maclafungin B-D。它们均表现出很强的抑制黄瓜枯萎病菌和立枯丝核菌生长的活性，是新的抗真菌先导化合物。从深海链霉菌12A35中分离获得6个lobophorins类抗生素，包括3个新抗生素lobophorins H-J，1个新天然产物O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide，以及2个已知抗生素lobophorins B和F，它们均对革兰氏阳性菌有抑制作用。其中新化合物lobophorin H抗革兰氏阳性菌活性与氨苄青霉素相当，且具有较强的选择性，具有进一步研究的价值。从卡伍尔氏链霉菌NA4中分离鉴定2个抗真菌活性单体bafilomycin B1和bafilomycin C1，它们对多种镰刀菌，灰霉病菌和立枯丝核菌等病原真菌有较强的抑制作用，具有良好的开发前景。通过对菌种的去重复化发现2株潜在新种，采用多相分类学方法完成菌种鉴定，分别命名为南海链单孢菌和渤海链霉菌。.通过该项目的实施，建立了整合基因筛选-活性筛选-化学筛选快速发现海洋微生物活性次生代谢产物的新途径，发现了一批潜在产生新型活性代谢产物的海洋微生物新资源和新型抗菌活性先导化合物，为研制具有自主知识产权的新型海洋微生物杀菌剂奠定物质基础。