肿瘤相关重组抗原蛋白与肿瘤治疗性DNA疫苗静电耦合成为复合纳米颗粒的初步研究

How to break immune tolerance of tumor is one of the crucial immunological problems. To verify immunological mechanism & effect of nanoparticle tumour vaccine, which was generated through expression of our recombinant tumor associated antigen survivin/HCGβ-CTP37 in Eoli combining with DNA tumor vaccine pVAX1-2PFcGB using electrical interation, we will study the nanoparticles in C57BL/6 mouse melanoma prophylactic model and therapeutic model in vivo. Meanwhile, in vitro assays to estimate nanoparticles for improving phagocytosis of APCs (antigen presenting cells); research the nanoparticle on DNA protection and increasing antigen expression. At last,the nanoparticle, as a novel tumor vaccine and presentding system, will probably become a new treatment method and mechanism against clinical cancer.

如何打破肿瘤免疫耐受是治疗肿瘤的关键免疫问题之一。研究表明DNA疫苗或蛋白疫苗均能引起并加强机体对肿瘤的特异性免疫应答。本研究前期通过将蛋白疫苗与DNA疫苗通过静电耦合成为纳米颗粒基础上，评价该新型疫苗抗肿瘤免疫应答机制及效果。具体而言，分别原核表达的重组肿瘤抗原蛋白survivin、HCGβ-CTP37，与已有的肿瘤治疗性DNA疫苗pVAX1-2PFcGB通过静电作用将蛋白与DNA耦合形成复合纳米颗粒，分别在C57BL/6小鼠黑色素瘤预防模型与治疗模型验证复合纳米颗粒疫苗的免疫应答机制及效应。体外实验评价纳米颗粒对APC（抗原递呈细胞）促吞噬作用；研究纳米颗粒对于DNA的保护作用、促进DNA抗原表达。被验证的纳米颗粒,作为形成一种全新的肿瘤疫苗形式与递送系统，将可能成为临床恶性肿瘤的攻克提供新的生物治疗手段与机制

项目背景：肿瘤免疫治疗日益成为恶性肿瘤治疗的重要手段,具有巨大的发展潜力与前景。 而肿瘤疫苗作为一种重要的主动免疫治疗策略，旨在激活机体自身抗肿瘤免疫，增强细胞免疫与体液免疫，打破肿瘤免疫耐受，从而达到控制或清除肿瘤的目的。本项目主要研究内容：本研究主要试图通过DNA-蛋白质静电耦合为一种全新的纳米颗粒疫苗，并评价其在小鼠黑色素瘤小鼠中的作用及机制。具体包括：（1）制备带有负电荷的DNA疫苗；原核重组表达含有阳离子肽段的蛋白疫苗。（2）证实编码相同肿瘤抗原的DNA与蛋白能够静电耦合为复合纳米颗粒。（3）评价该纳米颗粒疫苗对于小鼠黑色素瘤的预防作用和治疗作用及相关机制。主要研究结果：（1）在前期工作基础上进一步优化并构建了DNA疫苗包括pVAX1-survivin-CP、pVAX1-survivin、pVAX1-HCGβ-CTP37、pVAX1-HCGβ-CTP37-CP；进一步构建并优化表达获得重组肿瘤抗原蛋白包括survivin、HCG β-CTP37、CP、survivin-CP、HCGβ-CTP37-CP及多倍体(survivin)2-CP、( HCGβ-CTP37)2-CP，CP即含有阳离子肽段。（2）通过原子力显微镜（AFM）、DNA电泳阻滞实验、DNA酶I消化保护实验以及流式细胞术检测证实编码同一抗原（survivin或HCGβ-CTP37）的带负电荷DNA的能够与带正电荷的重组蛋白通过静电耦合为复合纳米颗粒，粒径为50-500nm；该纳米颗粒对于DNA具有保护作用，并且体外实验证实不会影响基因的表达。（3）通过小鼠黑色素瘤预防实验证实该纳米颗粒能够显著提高生存率，并且显著减小肿瘤体积。类似的显著抗肿瘤结果在治疗性实验亦得到证实。进一步分析发现，纳米颗粒接种组小鼠血浆与脾细胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-4显著升高，而IL-10却在各组间无显著差异。LDH释放细胞毒实验表明纳米颗粒活化并产生CTL对肿瘤细胞B16F10-survivin或B16F10-HCG β-CTP37杀伤活性显著增强。survivin或HCG β-CTP37特异性IgG抗体显著增强。上述结果表明纳米颗粒通过同时激发细胞与体液免疫应答发挥肿瘤作用。科学意义：该DNA-蛋白质复合纳米颗粒疫苗提供了一种全新的疫苗形式，并对黑色素瘤具有潜在的治疗价值。