ADH1参与白念珠菌对唑类药物耐药及汉防己甲素增效过程中外排泵相关的主要机制

我们前期发现，ADH1的表达产物Adh1p是白念珠菌对唑类耐药与汉防己甲素增效过程中的重要相关蛋白。为了揭示ADH1在该过程中的作用机制，本项目结合耐药的关键环节- - 外排泵的表达与功能进行研究。拟采用同源重组技术构建ADH1缺失突变株，分别以CLSI M27-A方案、Rh123荧光蓄积/外排实验测定ADH1缺失对药物敏感性、外排泵功能的影响；并构建外排泵基因CDR1/CDR2/MDR1/FLU1缺失突变株和双基因缺失突变株，结合实时荧光定量PCR、蛋白质组学技术，通过比较各突变株与野生株之间ADH1和外排泵基因在mRNA水平和蛋白质水平上的变化，判断ADH1在耐药与增效过程中的作用环节。由于白念珠菌ADH1具有显著不同于哺乳动物的特异性结构和功能，本项目的完成将为阐明ADH1在耐药过程中的新功能，并进而发现能够作用于该靶点的药物，进行抗真菌治疗联合用药、逆转耐药性具有重要科学意义。

项目系统证实了ADH1参与白念珠菌耐药，TET增效过程与外排泵机制相关。作用于该靶点的药物潜力明显。.（一）获得了ADH1参与耐药、TET增效的证据：.1 ADH1与耐药相关：耐药株ADH1及Adh1p上调；ADH1敲除株对FLC MIC80降低。.2 ADH1与TET增效相关：FLC+TET比其单独可下调ADH1、敏感株Adh1p；但ADH1敲除株的MIC80无差异。. (二) 获得了ADH1参与耐药、TET增效的外排泵相关机制的证据：.1 ADH1参与耐药的外排泵相关机制.（1）ADH1与外排泵相关：耐药株ADH1及外排泵基因表达上调；20株临床株ADH1与外排泵基因表达、MICs正相关；CDR1/CDR2高表达株ADH1上调。.（2）ADH1与外排泵表达：ADH1敲除株外排泵基因、蛋白下调。.（3）ADH1与外排泵功能.（i）ADH1调节外排泵功能：①耐药株Rh123蓄积减少、外排增强；②ADH1敲除株蓄积增强、外排减弱。.（ii）ADH1是能量代谢的关键基因：①耐药株细胞内ATP升高、膜电位和ROS降低；②ADH1敲除株ATP降低、膜电位和ROS升高。.（iii）ADH1和CRC途径共同影响外排泵功能：ADH1敲除株经AA作用后，蓄积增强，ATP、膜电位下降的程度更大。.（iv）同时抑制ADH1及CRC靶点可杀灭菌体：①ADH1敲除株生长明显迟缓；②其经AA作用后完全不生长。.（4）ADH1可影响致病力：①ADH1敲除株在体外、动物菌丝形成减弱；②该菌株SRB1上调；③ADH1高表达株感染后器官载菌多。.2 ADH1参与TET增效的外排泵相关机制.（1）ADH1与TET增效的外排泵机制相关：FLC+TET比单独时下调ADH1及外排泵基因表达，下调CDR1/CDR2/MDR1高表达株ADH1等基因。.（2）ADH1与TET增效作用的外排泵表达相关：FLC+TET比其单独作用ADH1敲除株外排泵基因、蛋白表达水平无差异。.（3）ADH1与TET增效作用的外排泵功能相关：FLC+TET比其单独时蓄积增加，膜电位及ROS增多，ATP、CI、CIII、CV降低。.（4）动物实验ADH1参与TET增效的外排泵机制：CDR1/CDR2高表达株（ADH1高表达），FLC+TET比其单独可延长生存时间，减少器官载菌量。