中医滚法样刺激对损伤骨骼肌细胞机械信号传导通路的影响

It is a key link in the study of manipulation mechanism how the cells in the body identify the change of manipulation force, and translate these characteristic mechanics signal into the physical and chemical signal which results in a series of biological effects. . Collaborating with University of North Texas Health Science Center, the project will study the effect of mechanical stimulation like Rolling Manipulation in Traditional Chinese Medicine on the mechanical signaling pathways of injured skeletal muscle cells in the multicellular mechanics simulation platform. The force receptor pathway and force sensitive ion channel way will be screened by the techniques of protein chip and patch clamp respectively. The skeletal muscle apoptosis, ultrastructure and metabolic indicators such as CPK will be tested after the injured skeletal muscle cells are loaded the mechanical stimulation like Rolling Manipulation when the possible screened pathways are blocked, which verify the validity of transduction pathways converting mechanical signal to electrical physiological and chemical signal. . The study will explain the signal transduction law initiating the biological effect of Chinese manipulation, which provides the theoretical basis and practical information for the mechanism of manipulation in Traditional Chinese Medicine.

体内细胞如何识别手法作用力的改变，并将手法特有的力学信号转变为电生理及化学信号，进而引起一系列生物学效应，是阐述手法作用机制的关键环节。本项目将联合美国北德克萨斯大学健康科学中心，在多细胞力学模拟实验平台开展滚法样刺激对损伤骨骼肌细胞机械信号传导通路的研究，应用蛋白芯片技术和膜片钳技术分别筛选力感受器途径和力敏感离子通道途径，并重新培养损伤骨骼肌细胞，对筛选出的可能传导通路加以阻断，在力学加载后检测骨骼肌细胞凋亡、超微结构及肌酸磷酸激酶等代谢指标的应答状况，验证该通路是否为滚法样刺激由力学信号转换为电生理及化学信号的转导途径。该研究将阐释推拿手法生物学效应启动环节的信号转导规律，为推拿手法的作用机制提供理论依据和实践资料。

主要研究内容：本研究模拟临床中医推拿㨰法操作，采集㨰法压力、频率、时间参数；采用FX-5000™细胞力学加载系统拟合㨰法压力--时间曲线。以细胞活性增殖率为指标筛选损伤骨骼肌细胞模型建立的药物浓度；以细胞代谢指标筛选对3D培养损伤骨骼肌细胞加载的适宜力学参数。采用电镜技术寻找㨰法样刺激改善骨骼肌损伤的形态学证据。应用蛋白质谱技术研究㨰法样刺激对损伤骨骼肌细胞力感受器途径相关的关键蛋白，筛选可能的力感受器途径，并进行western blot验证。使用膜片钳技术研究㨰法样刺激对损伤骨骼肌细胞力敏感离子通道的影响，筛选可能的阳离子通道，进行阻断验证。.重要结果及关键数据：本研究发现1.2mM地塞米松磷酸钠是损伤骨骼肌细胞模型建立的适宜浓度；2.5 lbs压力是FX-5000™细胞力学加载系统模拟临床中医推拿㨰法操作较好的力学参数。电镜结果表明㨰法样刺激能促进损伤骨骼肌细胞的恢复，表现为改善细胞器排列、减少细胞器肿胀、维持细胞膜的完整性；蛋白质谱研究表明㨰法样刺激的关键蛋白可以影响较有意义的18个生物学过程、16个细胞组分和13个分子功能，其中氧化应激通路、脂质代谢PPAR信号通路、力敏感Hippo/Yap通路是手法起效的关键通路，㨰法样刺激可以调节CD36、FABP4、P-LATS1及P-Yap（Ser127）等关键蛋白，减轻骨骼肌细胞的损伤。膜片钳等电生理研究表明㨰法样刺激干预可降低损伤骨骼肌细胞内Ca2+浓度，减轻损伤细胞的凋亡，促进超氧化物歧化酶（SOD）活力的恢复、有毒脂质代谢醛类产物丙二醛（MDA）的减低以及肌酸激酶（CK）活力降低；但这些效应可被Ca2+拮抗剂阻断，证实Ca2+是手法起效的关键离子通道；此外，K+通道也参与了损伤细胞的修复。.科学意义：本实验为临床工作者采用㨰法治疗骨骼肌损伤类疾病时的施力轻重、操作频率及时间提供了参考依据；揭示了中医㨰法治疗骨骼肌损伤起效的多条信号转导通路；通过多层面分析㨰法改善损伤骨骼肌细胞的内在机制，为手法治疗此类疾病和损伤提供了理论依据和实践资料。