黒骨藤总黄酮和总强心苷抗类风湿性关节炎的物质基础及其调控Th1和Th2细胞的机理研究

P.forrestii Schltr.is main the Miao Nationality Medicine for the treatment of rheumatoid arthritis (RA). and is This topic researches show that the total flavonoids and total cardiac glycosides of P.forrestii Schltr. could significantly reduce the rat foot swelling by adjuvants and type II collagen induced in. Rat paw swelling was not change in the delivery period and discontinuation after 3 months, The Characteristic of hig therapeutic effect and low toxicity is of great significance in the treatment of RA drugs, but the active ingredient and its mechanism of action is not clear..The fingerprint of total flavonoids and total cardiac glycoside of P.forrestii Schltr.,the fingerprint of drug metabolism by rat serum, liver,urine and by rat fibroblast will be researched by using the HPLC-MS-PDA-ELSD analysis, separation method. The compounds of P.forrestii Schltr.will be preparated. The change of Th cell of rats before and after drug administration will be researched , TNF-α 、IL-1βinflammatory factors and T-bet mRNA expression will be analysed by Using Enzyme linked immunosorbent assay method for elucidating the mechanism of rat synovial cell apoptosis.These researches will provide a scientific basis for the study of high efficiency and low toxicity of anti-rheumatoid arthritis drugs.

黒骨藤为治疗类风湿性关节炎的主要苗药,对类风湿性关节炎具有明显的治疗效果且属低毒药物；黒骨藤总黄酮和总强心苷能显著减轻由佐剂和Ⅱ型胶原蛋白引发的大鼠关节炎症的肿胀，停止给药3个月后，肿胀度不会增加。但该药物抗类风湿性关节炎的有效成分及其作用机理尚不明确。.本项目将采用HPLC-MS-PDA-ELSD等分析、分离方法，分别进行黒骨藤总黄酮和总强心苷药物的指纹图谱、药物经大鼠代谢后的血清、肝脏和尿液产物的指纹图谱、药物经大鼠成纤维细胞代谢后产物的指纹图谱研究，发现上述各种图谱中具有相似结构的化合物，从而制备黑骨藤抗类风湿性关节炎的单体化合物。采用组织切片、酶联免疫等方法，分别进行大鼠滑膜组织、TNF-α、IL-1β等炎性因子、Th细胞亚群以及T-bet的mRNA 表达的研究，阐明黑骨藤有效成分致大鼠关节滑膜细胞凋亡和细胞外基质降解的抗炎机理，为研究高效低毒型的抗类风湿性关节炎药物提供科学依据。

本项目第一部分研究分别以50%乙醇和95%乙醇为提取液，采用回流提取和浸提的方式，分别得到提取物浸膏，将提取物用大孔树脂D101进行分离，分别得到水、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇-水溶液洗脱物，回收率95.44%。将乙醇浸提将得到的浸膏分别使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到各萃取片段和不容物。再将90.1g乙酸乙酯萃取物用硅胶层析方法进行分离纯化，得到氯仿分离物，氯仿：甲醇为10:1分离物，氯仿：甲醇为5:1分离物，氯仿：甲醇为1:1分离物，甲醇分离物。所有提取物和分离物分别测量总黄酮、总皂苷、杠柳苷含量，测得结果总黄酮含量最高的是甲醇分离物，总皂苷含量最高的是40%乙醇分离物，杠柳苷含量最高的是氯仿：甲醇为5:1分离物。.将所得提取和纯化片段进行小鼠耳肿胀模型动物实验，40%乙醇分离物组、60%乙醇分离物组、乙酸乙酯萃取物组、甲醇分离物组和模型组相比较有显著性差异，氯仿：甲醇为5:1组和模型组相比较有极显著差异，有较好的抗炎效果。将40%分离、氯仿：甲醇为5:1分离物、甲醇分离物进行弗氏佐剂型大鼠关节炎模型动物实验，甲醇分离物组和模型组相比有显著性差异，40%分离物组、氯仿：甲醇为5:1分离物组和模型组相比有极显著差异，从小鼠耳肿胀实验和弗氏佐剂型大鼠关节炎模型动物实验结果得出，抗类风湿性关节炎的有效部位是氯仿：甲醇=5：1分离物，40%乙醇分离物，甲醇分离物，且药效依次减弱。根据抗炎实验结果得出，总黄酮、总皂苷和杠柳苷均是抗类风湿的有效成分，且含量越高抗炎药效越好，有明显的量效关系。.本项目第二部分研究首次采用代谢组学方法对黑骨藤中的抗炎有效化合物进行了筛选，为天然产物中有效化合物的研究提供了一种新的思路。首先，采用Box-Benhnken Design (BBD)实验设计原理，以色谱峰数量和分离度为指标对黑骨藤50%乙醇提取物的液相色谱条件进行了优化，在优化条件条件下获得了黑骨藤的指纹图谱。通过小鼠耳肿胀实验对黑骨藤单方药物乙醇提取物的乙酸乙酯萃取片段的最佳给药剂量进行了选择。实验结果表示，当给药剂量为1600 mg•Kg-1BW时，模型组与给药组的耳肿胀率有显著性差异(p<0.1)。由于药液浓度及给药体积的限制，因此选择1600 mg•Kg-1BW作为给药剂量。再次，对空白组与给药组给药后血浆、胸腺、脾脏、肾脏及肝脏内的化合物进行