基于代谢组学的白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制的研究

The purpose of this research is to study the cross drug-resistance mechanisms of azoles against Candida albicans by metabolomics technology which combines the mathematical analysis with high-throughput analytical instruments such as UPLC-Q-TOF-MS and GC-MS. The first step is to generate the cross drug-resistant strains by culturing C. albicans in the presence of azoles. Then, by comparing the metabolic characteristic spectrum between drug-sensitive and drug-resistant strains with and without azole treatment, we can find the potential biomarkers which are closely associated with cross drug-resistance. On that basis, the corresponding metabolic pathways will be targeted and new quantitative metabolomics for those particular pathways will also be established. By combining the data of genomics and proteomics, we can roughly select certain drug-resistance targets. Meanwhile, by treating the strains with the blockers of the critical pathways or gene knockout, we can analyze the roles of the pathways in drug-resistance. Furthermore, we will combine the active compounds of Chinese herbal with azole against drug-resistant strains to investigate the synergism mechanisms of antigungal drugs, so that we can lay a foundation for new antifungal drugs development and meanwhile, provide methods and basis for further metabolomics research on the mechanism of drug-resistance.

本课题拟采用UPLC-Q-TOF-MS、GC-MS等高通量分析仪器与数学解析相结合的代谢组学技术研究白念珠菌对唑类药物的交叉耐药机制。首先对白念珠菌进行加压诱导获得唑类药物交叉耐药菌株，通过比较敏感菌和耐药菌本身代谢谱的差异以及唑类药物处理后敏感菌和耐药菌的应激代谢谱差异，寻找与耐药密切相关的代谢生物标志物组，定位对应的代谢通路，再次建立针对特定通路的定量代谢组学，结合已有的基因组、蛋白组数据，初步选定一批可能的耐药相关靶标。同时，采用外加对应通路阻断剂及敲除选定的靶标基因的方法，分析该靶标在白念珠菌耐药性形成中的作用。在此基础上，将我们前期发现的具有抗真菌增效作用的中药活性单体与唑类药物联合作用于耐药菌，考察其代谢谱变化，寻找相关药效标志物，探索两药合用协同抗耐药真菌机制，为开发新型抗耐药真菌药物奠定理论基础，同时也为病原微生物耐药机制的代谢组学研究提供方法依据。

近年来 ，真菌耐药发生率呈逐年上升趋势，真菌对氟康唑等氮唑类药物的耐药性最为严重，成为临床抗真菌治疗失败的原因之一。为探讨真菌耐药相关的分子机制，本课题采用了UPLC-Q-TOF-MS、GC-MS等高通量分析仪器与数学解析相结合建立了多层次微生物代谢组学技术平台，建立了包含氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、磷脂类、多胺类等的白念珠菌内源性代谢物数据库。并以白念珠菌耐药机制为研究对象，首先对白念珠菌进行氟康唑加压诱导获得唑类药物交叉耐药菌株，采用代谢指纹筛选，比较敏感菌和耐药菌本身代谢谱的差异以及其他唑类药物处理后敏感菌和耐药菌的应激代谢谱差异，并针对特定的代谢通路进一步优化定量代谢组学方法，对其进行全面精确地定量表述，多尺度、最大限度提取样本中有效信息。共发现65种差异代谢物，其中25种差异代谢物是菌株和药物刺激双因素交互作用产生的。这些标志物主要涉及氨基酸代谢、三羧酸循环、应激代谢、甘油磷脂代谢和鞘脂代谢等通路，揭示了耐药菌可能通过增强对外界刺激的抵抗力、降低细胞内活性氧、增强药物外转运蛋白的过表达、改变细胞膜流动性和通透性以及影响线粒体功能来降低对抗真菌药物的敏感性，从而达到抗真菌药物作用。在此基础上，将其他常用真菌治疗药物和我们前期发现的具有抗真菌增效作用的中药活性单体作用于耐药菌，考察其代谢谱变化，寻找相关药效标志物，进一步探索真菌耐药机制，发现SPE1和TPS1两个耐药相关靶标基因。同时利用外加靶标基因相关通路阻断剂或敲除靶标基因的策略证实了其在白念珠菌耐药性形成中的作用。有关实验结果为白念珠菌对唑类药物的耐药机制研究提供代谢组信息，完善其系统生物学研究体系，并发现新型耐药机制；也为开发全新抗真菌药物奠定理论基础，同时也为病原微生物耐药机制的代谢组学研究提供方法依据。