靶向促红细胞生成素的新型核酸适配体分子群筛选评价及基础/应用研究

针对重要造血因子EPO，在我课题组筛选得到抗rhEPO特异性适配体807，其可作为仅特异性识别内外源EPO的新型分子元件的良好基础之上，以逐级剪裁和倍数定点剪裁进化等分子生物学和化学生物学的研究思路为指引，巧妙设计高通量的多簇适配体分子群，利用分子群间存在多种渐进/步进型单碱基差异之特征，从共性和个性规律之角度，结合荧光探针、生物质谱等策略，进行目前机制未明的适配体-靶蛋白相互作用位点、结构域确证等基础研究。最终获得涵盖保守序列和保守结构域的最短适配体活性片段，在分子水平上为临床分析及EPO类兴奋剂的检测提供新型的高灵敏度高特异性检测方法；在细胞和组织水平上进行EPO的特异性信号示踪，并探讨适配体在过表达EPO肿瘤细胞/组织上的明确作用部位，包括其与抗体、受体作用位点差异等问题。本课题将提供一类新型的适配体活性簇筛选及评价方案，将为适配体-靶蛋白间作用机制研究领域提供重要的技术方法。

本项目针对适配体分子技术中，目前适配体-靶蛋白结合位点及结构域不明，不能保证凡筛出的适配体即有效的科学难点，聚焦于具有自主知识产权的靶向重要造血因子促红细胞生成素EPO的特异性适配体807，基于分子生物学和化学生物学思路，巧妙设计了逐级剪裁、倍数延长、定点进化等的研究策略，构建了高通量的多簇适配体分子群，发展了基于表面等离子体共振(SPR)技术的新方法，并开展亲和力筛选评价，最终获得了涵盖保守序列和保守结构域的最短适配体活性片段-In27，结合荧光探针、圆二色谱、SPR、等热滴定等技术对In27及相关序列进行了详尽的结构表征，结果提示In27在结合时应是以空间高级结构如反平行G-四聚体形式存在，茎部双螺旋则对该高级结构具有正向促进作用。并基于该序列构建了最短适配体活性簇。该活性簇具有可通过G-四聚体刚性骨架临近碱基及支撑序列调节活性的特点，从而最终实现了EPO-α适配体的结构与活性间的明晰化，亦为区分识别EPO-α及结构近似EPO蛋白提供了新的可能。在分子、细胞及组织水平上，发展了包括实时定量PCR、纳米荧光探针等3种高灵敏度高特异性检测或示踪方法；构建了一种新型的寡核苷酸功能化荧光纳米碳点型生物探针并具有良好的靶向示踪诊断能力，并且展示出在治疗方面的良好潜力。明确了适配体在过表达EPO肿瘤细胞上的明确作用部位在于胞膜和胞浆部位。综上所述，本项目在资助周期内，成功提供了一类新型的、实用性强的适配体活性簇筛选及评价方案，为适配体-靶蛋白间作用机制研究领域提供重要的技术方法。并发展了多套新型荧光探针策略，成功用于分子及细胞、组织层面的EPO特异性传感及示踪。