核酸适配体筛选进程监测及机理研究

Aptamers are DNA or RNA oligonucleotides capable of binding different classes of targets with high affinity and selectivity. Aptamers are often generate by systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). However, the productive SELEX process can be problematic by explicit and implicit factors , such as, PCR bias and pool folding condition. Thus, it delays the discovery and application of aptamers. In this proposal, we will aim at solving the key factors in the selection process. First, FCE-SELEX, mass spectrometry and ultra micro-fluorescence technique with Heating electroelution technology will be used to monitor the progress of selection，so that we can decide the selection results. Comparing the emulsion PCR with traditional PCR, it will help us to know the PCR bias effect. To detail the folding and unfolding condition for the aptamer pool will help the target and aptamer to form consistent complexes in different selection progress. We will establish the solid method for consistent folding method, thus to improve the present selection efficiency. At last, we will develop 3 to 5 new aptamers for further study and application. These results from this proposal will be significant for clearing some key factors which determine the SELEX success or fail. It will be stated in theory so that we could promote new aptamer discovery and application.

核酸适配体（aptamer）是一类能识别特定靶分子的单链DNA或RNA，可以通过体外筛选获得。目前筛选适配体的方法仍存在许多问题，许多显性和隐性的影响因素尚不明确。筛选实验由于缺乏系统的理论指导，导致新适配体的发现和应用受到限制。本项目将通过以下途径来研究筛选过程中的关键因素。首先利用FCE-SELEX技术、质谱技术、超微量荧光样品的加热电洗脱技术，建立几种高灵敏的筛选进程监测方法；在此基础上，通过比较乳浊液PCR和常规PCR扩增对筛选的影响；研究筛选文库的条件依赖折叠过程，明确各种因素对适配体和靶标结合的影响；建立有效的文库变复性方法，确保筛选进程中复合物的正确形成，从而提高现有筛选体系的效率；筛选3-5种重要蛋白质的适配体，并验证相关的筛选理论。以上研究成果将会系统揭示筛选过程中各种显性和隐性因素对筛选成败的影响，为适配体的筛选提供重要的技术支持和理论指导，促进新适配体的发现和应用。

核酸适配体是一类人工筛选获得的单链的DNA或RNA，具有类似抗体的性质。由于分子量小、可以体外筛选和合成、质控简单、靶标广泛、产成本低，可以常温运输与保存等优点，被科研界和产业界普遍看好。但适配体领域的发展一直受制于筛选技术的进步。目前的适配体筛选技术很难获得真正可用的高质量适配体。..本课题主要围绕深入理解筛选机理，建立高效的筛选方法而展开。主要研究内容包括：.. 1、PCR 偏好扩增（PCR bias）对筛选成败的影响；.. 2、筛选进程监测技术；.. 3、筛选文库的折叠与变复性处理方案，对筛选成败的影响；..4、在深入理解筛选机理的基础上，建立快速、高效的筛选方法。.. ..通过高通量测序来研究筛选规律， 确认并解释了PCR偏好对筛选成败的影响；建立了迄今最简单的筛选进程检测方法。在此基础上，建立到均相筛选方法，以及基于单分子收集的筛选方法；使得筛选效率大幅提升。筛选成功率由公认的30%提升到80%左右。平均获得富集文库的时间缩短至7天。基于对筛选机理的深入认识，我们建立了快速的筛选方法。 筛选速度和筛选成功率均达到国际领先水平。筛选的适配体靶标数量是预期的5倍，大大超过预期目标。组织了4次（3线下，1次线上）学术会议，以及为国内110多个实验室提供了筛选技术培训。乳液PCR产品，小分子筛选试剂盒等产品已经实现产品化。..在2020年初的新冠疫情中，我们在15天之内就拿到了新冠S蛋白和N蛋白的核酸适配体。并在第一时间向外公布了序列信息，为后续的应用研究奠定了基础。