HSV-1 ICP22转录抑制作用分子机制及其对病毒增殖的生物学意义

The immediate-early (IE) protein encoded by herpes simplex virus 1 (HSV-1) is critical for viral proliferation. One of the IE protein, ICP22, functions as an regulator of viral late gene expression and induces viral proliferation, but exerts transcription repression non-specifically on cellular and viral promoters in vitro for unknown mechanism and reason. We previously revealed that transcription repression by ICP22 is related to cellular positive transcription elongation factor b (P-TEFb), through inhibiting transcription elongation of RNA polymerase II (RNAPII) by P-TEFb phosphorylation. Base on our previous findings, this application will further investigate the molecular mechanism of transcription repression by ICP22 like how does ICP22 affect RNAPII transcription elongation by interacting with P-TEFb, and work on transcription regulation by ICP22 on cellular genes especially those antiviral immunogenes and HSV-1 IE, E and L genes together with other viral regulatory proteins by using gene expression analysis and protein-protein interaction. The purpose of this research is to explore biological significance of this transcription repression by ICP22 for viral infection and proliferation.

HSV-1编码立即早期蛋白对该病毒感染增殖至关重要，其中之一的ICP22在病毒感染过程中发挥着促进下游基因表达的功能，然而该蛋白却在体外转录实验中表现出目前对其机制和功能仍然未知的非特异抑制细胞和自身病毒启动子转录的作用。我们的前期研究揭示ICP22转录抑制作用与细胞转录调控因子P-TEFb有关，涉及阻碍该因子激活RNA聚合酶II(RNAPII)转录延伸功能的发挥。本项目计划在前期研究的基础上，利用蛋白质相互作用和基因表达分析等实验手段，深入分析ICP22如何利用P-TEFb来抑制宿主细胞RNAPII的转录，以及由此造成的对宿主基因尤其抗病毒免疫相关基因转录的影响。另一方面，联系其它病毒调控蛋白，分析在病毒感染水平上ICP22与这些调控蛋白对病毒三期基因：立即早期、早期和晚期基因转录表达的影响，从而系统探讨ICP22这一转录抑制作用对病毒复制增殖的功能和生物学意义。

HSV-1编码ICP22对病毒增殖至关重要，该蛋白影响RNA聚合酶II（RNAPII）行使的基因转录，对细胞和病毒自身基因转录均具有抑制作用，然而对这一转录抑制作用机制和其对病毒增殖的影响知之甚少。我们的前期研究发现ICP22在HSV-1感染细胞内结合转录延伸因子P-TEFb，通过课题的研究，揭示了ICP22与P-TEFb分子中的CDK9蛋白结合，并且结合位点位于ICP22蛋白中在α疱疹家族中高度保守的160-292氨基酸序列，以及CDK9蛋白中包含ATP结合位点和周期蛋白激酶PITALRE标志的100-200氨基酸序列。ICP22影响RNAPII CTD亚基Ser-2的磷酸化而没有影响Ser-5和负性转录延伸因子NELF的磷酸化。同时，ICP22也没有影响到细胞内P-TEFb和HEXIM1蛋白的相互作用。染色质免疫沉淀实验揭示ICP22阻碍P-TEFb分子募集到病毒α、β和γ基因启动子区，发挥这一作用至少需要ICP22保守的160-292氨基酸序列、核定位信号和核苷酸化位点。细胞转录因子NF-κB、病毒调控蛋白VP16和ICP27可以解除ICP22对RNAPII转录的抑制，具体表现为NF-κB非特异解除ICP22对RNAPII核心启动子TATA box的转录抑制，VP16特异解除ICP22对病毒α基因启动子的转录抑制，ICP27特异解除ICP22对病毒β和γ基因启动子的转录抑制。病毒调控蛋白ICP0、ICP4和细胞顺式调控元件ATF、SP1、AP1、OCTA和CAAT对ICP22转录抑制作用没有影响。利用同源重组方法构建的ICP22缺失HSV-1病毒表明ICP22对HSV-1增殖不可或缺。综合ICP22转录调控功能和机制实验数据，以及ICP22对病毒复制增殖的影响，揭示ICP22可能通过结合转录因子P-TEFb从而影响宿主RNAPII的转录进而发挥促进HSV-1病毒复制增殖的途径。.课题通过筛选与ICP22-UL31病毒复合物具有相互作用的宿主蛋白发现跨膜蛋白TMEM140结合UL31病毒蛋白，并揭示了TMEM140通过阻碍HSV-1病毒子代核衣壳出核而抑制病毒增殖的效应。此外，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建的病毒UL7基因缺陷的HSV-1病毒，揭示了UL7蛋白通过影响病毒α基因转录表达而发挥促进病毒复制增殖的效应。