牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）核酸适配体的筛选、结合机制及应用研究

In this proposal, bovine pregnancy-associated glycoprotein (bPAG) could be isolated and purified from fetal cotyledons. Then, the aptamer to bPAG with high recognition and specificity could be obtained by a magnetic beads - based Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (MB-SELEX) procedure, using the bPAG as the target molecule. After SELEX, the PCR products were cloned, and sequenced. The selected aptamers will be analyzed with the professional software mfold for structural analysis and be determined for binding coefficient with the fluorescent labeling protocol. Furthermore, based on the molecular simulation and molecular docking technology, the recognition regulations and structure-activity relationship of aptamer and bPAG will be explored. Finally, some rapid methods will be developed for on-site qualitative detection of bPAG by combined with the colloidal gold labeling principle, using bPAG aptamer as a recognition molecule. The methods could be perform fast, simple, low-cost and visual detection of bPAG in the serum and milk, which will greatly meet the requirement of on-site monitoring of the dairy farms. Furthermore, the research will be of great significance for improving reproductive efficiency of cows and economic benefits of cow breeding.

本项目以奶牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）为研究对象，从奶牛胎盘中提取分离纯化bPAG，然后以bPAG为靶分子，以磁珠为筛选介质，运用SELEX技术筛选得到与bPAG具有高特异性和高亲和力的核酸适配体，对筛选的产物进行克隆、测序，运用mfold软件对适配体的二级结构进行分析，测定适配体的亲和力和特异性。同时利用计算机模拟及分子对接等技术，揭示核酸适配体与靶分子相互作用的构/效关系和生物分子识别规律，为核酸适配体的设计、筛选和性能评价提供理论指导。最后，将筛选得到的核酸适配体作为识别分子，结合胶体金标记，建立基于胶体金显色的比色分析和基于胶体金侧向层析原理的PAG快速检测方法，实现奶牛血清、牛奶中bPAG的简便、高灵敏、可视化、低成本检测，用于奶牛早期妊娠诊断，满足养殖场实际生产需要。本项目的实施，对于提高新疆奶牛繁殖效率，增加牧场养殖经济效益具有重要意义。

在规模化奶牛养殖中，奶牛产犊间隔长、繁殖效率低仍是影响奶牛养殖业发展的主要因素，而对配种后奶牛准确及时地进行早期妊娠诊断，是缩短产犊间隔、提高奶牛繁殖效率的重要手段之一。妊娠相关糖蛋白（ PAG）是偶蹄动物胎盘滋养层合成并分泌的一类糖蛋白，常作为一种生物标志物用于家畜早孕检测。目前，基于免疫分析技术检测PAG已成为国际上主流的家畜早孕快速检测方法。然而，PAG检测技术目前被国外公司所垄断，主要原因是高纯度的PAG蛋白不易获得，进而限制了检测技术的研发和应用，再者，抗体的制备周期长、成本高，也导致PAG检测产品价格较高（40元/头次）。. 针对目前PAG检测存在的问题，本项目首先采用密码子优化策略和生和真核表达系统，制备了bPAG4、bPAG6、bPAG9、bPAG16四种重组蛋白，相对分子质量分别为48kDa、46kDa、68kDa和48kDa，纯度达到90%的以上，ELISA分析显示，重组蛋白均具有免疫反应性。然后以重组蛋白bPAG9为靶标，利用磁珠-指数富集配体系统进化技术（MB-SELEX）筛选了多条特异性识别bPAG的核酸适配体，解离常数达到nM级别。二级结构预测结果显示，bPAG适配体具有典型的茎环结构。第三，以适配体A24为研究模型，对其进行截短优化，获得3条截短的适配体序列，其解离常数（Kd值）低于5.35nM，然后以亲和力最高、序列最短（26bp）的适配体A24-3为研究对象，利用圆二色谱和分子模拟计算，探讨适配体与靶标bPAG9的分子结合机制。研究发现，两者是通过氢键、π-π相互作用和静电相互作用形成稳定复合物。第四，以筛选的适配体为识别分子，建立了bPAG比色快速检测新方法。在优化条件下，方法检出限低于1ng/mL，且具有高的特异性。采用所建方法对配种后30d的奶牛血清进行检测，妊娠诊断准确率达到90%以上。. 本研究筛选的bPAG适配体具亲和力高，生产成本低等优点，为奶牛早孕检测技术的研究提供了新型识别分子。同时建立了奶牛血清中bPAG的简便、可视化、低成本检测，为奶牛早孕检测提供新的技术，对于提高奶牛繁殖效率，增加牧场养殖经济效益具有重要意义。