勃利霉素对大豆疫霉细胞周期蛋白抑制作用机理研究

Macrolide antibiotics borrelidin has high and specific anti-fungal activity against Phytophthora sojae, which was superior to metalaxyl used widespread. Our previous research revealed that the antifungal activity of borrelidin against P. sojae was mediated by inhibition of threonyl-tRNA synthetase (ThrRS) via the formation of ThrRS-borrelidin complex to inhibit the protein synthesis. As a cell cycle inhibitors, borrelidin was speculated to inhibit the cell cycle relative protein of P. sojae. In order to further study of the mechanism of anti-fungal activity of borrelidin, the cell-cycle dependent kinase psCdc2 of P. sojae was cloned by PCR amplification technology, and qRT-PCR was used to analyze the gene expression mode, and transient gene silencing technology and functional complementation of yeast mutant were utilized to reveal the gene function; S. cerevisiae Cdc28 mutant complemented by psCdc2 and P. sojae psCdc2 mutant were treated by borrrelidin and analyzed to clarify the inhibition of borrelidin on the cell cycle relative protein. Those studies will reveal the function of cell cycle relative protein of Oomycete, and clarify further the mechanism of anti-fungal activity of borrelidin against P. sojae, and provide fundamental basis for new anti-fungal agent.

大环内酯类化合物勃利霉素高效抑制大豆疫霉，效果优于现广泛使用的甲霜灵。我们的前期研究显示，勃利霉素可以通过与大豆疫霉的苏氨酸tRNA合成酶形成复合体抑制蛋白质合成。同时勃利霉素作为细胞周期的抑制剂也可能具有抑制大豆疫霉细胞周期蛋白的作用。为进一步研究勃利霉素对大豆疫霉的抑制机理，拟采用PCR基因扩增技术克隆大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2，利用qRT-PCR分析其表达模式，利用瞬时基因沉默技术和酵母异源功能互补方法研究psCdc2基因功能，通过药物处理大豆疫霉基因沉默突变体和酵母重组psCdc2转化子的研究明确勃利霉素对大豆疫霉细胞周期蛋白的抑制作用。本项目的完成将揭示卵菌细胞周期蛋白的功能，阐明勃利霉素多途径抗卵菌作用机理，为研发新型杀菌剂提供理论基础。

植物病原卵菌严重危害农业生产，导致许多作物、花卉等发生灾难性病害。目前主要防治方法是利用化学药剂，防治效果不理想，又给生态环境、人畜生存质量、非靶标生物生存等带来了一系列负面影响。而且，化学杀卵菌剂的抗性问题日益严重。大环内酯类化合物勃利霉素高效抑制大豆疫霉，效果优于现广泛使用的甲霜灵。我们的前期研究显示，勃利霉素可以通过与大豆疫霉的苏氨酸tRNA合成酶形成复合体抑制蛋白合成。同时勃利霉素作为细胞周期的抑制剂也可能具有抑制大豆疫霉细胞周期蛋白的作用。为研究勃利霉素对大豆疫霉的抑制机理，采用PCR扩增技术从大豆疫霉的总RNA中成功地克隆了大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2，将其连接到表达载体pET32a，转化到大肠杆菌中进行体外表达。大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2经过诱导后，在菌体内形成包涵体，利用离心将其与其他杂蛋白分离，并通过变复性获得可溶性蛋白用于后续的药物结合实验。利用荧光光谱分析法分析勃利霉素与大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2的结合特性，结果表明勃利霉素与psCdc2的相互作用为动态猝灭的碰撞过程，该机制是区别于勃利霉素与苏氨酸tRNA合成酶形成复合体的静态猝灭相互作用，两者不同抑制机制也揭示了勃利霉素多途径抑制作用机制的多样性。对基因的表达分析结果表明其在多个发育阶段均表达。本项目还建立了瞬时基因沉默技术体系和酵母突变体技术体系，对基因功能的研究未得到预期结果，仍在研究中。除了解析了勃利霉素与大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2存在相互作用外，项目研究还通过生物信息学分析找到了勃利霉素与spliceosome-associated protein formin binding protein 21 (FBP21)存在相互作用在大豆疫霉基因组内的同源蛋白hypothetical protein PHYSODRAFT_471379，为今后该靶标的研究提供了信息。基于勃利霉素具有多种抑制活性的特点及其对大豆疫霉苏氨酸tRNA合成酶结合抑制其ATP活化氨基酸过程，我们认为勃利霉素对大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶的作用也可能主要影响其催化ATP活性。这一理论假设有待进一步证实。