辣椒疫霉Gα亚基在孢子囊和游动孢子发育过程中的作用机制研究

Phytophthora capsici is a highly destructive invasive pathogen that attacks pepper, tomato, snap beans, most cucurbit hosts and economic losses are experienced annually. Management of diseases caused by P. capsici is currently limited by long-distance movement of the pathogen in surface water used for irrigation, the presence of fungicide-resistant pathogen populations, and a lack of commercially acceptable resistant host varieties. Sporangia and zoospores are the main dissemination structures, but little is known about molecular mechanisms of development. The biology functions and molecular mechanism of Gα subunit during sporangia and zoospore development will be illuminated by the following strategies: (1) Analysis of the phenotypes in Gα gene-silencing and gene-overexpression mutants, (2) Explore the interaction relationships between Gα and upstream GPCRs by yeast two hybrid, (3) Screen Gα downstream interaction proteins by protein pull-down and CO-IP assays, (4) Analysis the effects of Gα conserved amino acids mutation on protein interactions and biology functions. Our study will reveal development-related molecular mechanism during sporangia and zoospore development regulated by Gα, the characteristics of Gα compared to pathogenic fungi will inspire new idea for identification of candidate new fungicide targets and design disease control strategies.

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）侵染辣椒、番茄、菜豆和大多数葫芦科蔬菜，引起蔬菜疫病，造成严重的经济损失。辣椒疫霉易传播、易产生抗药性、生产中缺乏抗性品种，导致病害难以控制。辣椒疫霉主要依靠孢子囊和游动孢子传播，但对其发育的分子机制了解甚少。本项目通过沉默或过表达辣椒疫霉的Gα编码基因，分析突变体的表型变化；通过酵母双杂探索Gα和上游GPCR之间的互作关系；蛋白质Pull-Down或免疫共沉淀筛选下游的互作蛋白；Gα保守氨基酸位点突变对生物学功能和蛋白互作的影响等研究，揭示Gα在孢子囊和游动孢子发育过程中的功能和信号传导机制。研究结果不但可以揭示辣椒疫霉Gα调控孢子囊和游动孢子发育的分子机制，与其它模式物种的Gα信号传导机制进行比较，有望挖掘成为新的农药防治靶标，并设计有针对性的病害防治策略。

甲羟戊酸合成途径（mevalonate pathway）在真核生物中非常保守，是合成萜烯类化合物（terpenes）和类萜类化合物（terpenoids）以及甾醇类化合物（sterol）的重要步骤。虽然疫霉菌不能合成甾醇类物质，但是其甲羟戊酸合成途径是完整的。为揭示大豆疫霉中甲羟戊酸途径在生长发育中的功能，1.使用抑制剂洛伐他汀（lovastatin）处理抑制下游产物合成，对大豆疫霉的生长发育进行研究；2.使用生物信息学方法挖掘大豆疫霉甲羟戊酸合成途径，对该途径中的基因在大豆疫霉不同生活史阶段和洛伐他汀处理下的转录模式进行了研究；3.使用生物信息学方法，分析了该途径中GGPP合成酶PsBTS1的保守功能域；4.使用酿酒酵母敲除突变体功能互补和GFP标记研究了PsBTS1的酶活功能和亚细胞定位；5.使用CRISPR/Cas9敲除GGPP合成酶PsBTS1研究其生物学功能。研究结果显示，1.洛伐他汀抑制大豆疫霉的生长、孢子囊的产量并诱导游动孢子的休止；2.甲羟戊酸途径中的基因在不同生活史阶段和洛伐他汀处理下具有多样的转录模式；3.GGPP合成酶基因PsBTS1属于type3型合成酶，能够回补酿酒酵母敲除突变体在低温生长缺陷，定位在大豆疫霉的细胞质中；4.敲除PsBTS1后，菌丝生长变慢并且卵孢子产量上升。研究结果显示，甲羟戊酸途径在大豆疫霉的生长发育中发挥重要作用，PsBTS1在菌丝生长和卵孢子产生过程中发挥重要作用。研究结果为揭示大豆疫霉生长发育的分子调控机制提供了新的线索。