三唑磷对斑马鱼miR-99及其预测靶标ckmt2的调控作用的研究

Creatine kinase (CK) is an enzyme that catalyzes the reversible conversion of ADP and phosphocreatine into ATP and creatine, and was reported to be tumor marker in the diagnosis of some primary cancer. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small (20-23 nucleotides), endogenous and non-coding RNAs, emerged as key post-transcriptional regulators of gene expression, and directly involved in cancer occurrence, development, and process of chemical toxicology. Our latest results shown the expression of miR-99 and its predicted target gene ckmt2 in zebrafish will change after treated with triazophos. This is the only report shown triazophos has potential carcinogenicity. Numerous studies must be conducted to determine the hazards of the particular pesticide and its use.We propose to investigate the co-expression alteration of miR-99 and ckmt2, and the interaction of miR-99 and 3'-UTR of ckmt2 after treated with triazophos in zebrafish. Try to figure out the mechanism of the regulation ckmt2 by miR-99 with quantitative RT-PCR and cell transfection techniques. With this study, we can clarify the interaction of miR-99 and ckmt2 in the toxicology effects of heterologous chemicals and we can also classify the carcinogenic potential of the pesticides triazophos.

肌酸激酶(Creatine kinase,CK)能够可逆的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。近年来发现，肌酸激酶可作为肿瘤诊断的标志酶。MicroRNA是一类长度约为20-23nt的非编码小RNA，在转录后水平对基因表达水平进行调控，是癌症发生、发展及化学物质毒理学等过程中重要的表观遗传调控因子。我们的研究结果表明，三唑磷可引起斑马鱼体内miR-99及其潜在靶基因ckmt2的表达发生变化。这是否预示三唑磷具有潜在的致癌效应，尚未见相关报道。本项目拟以斑马鱼miR-99为对象，采用实时荧光定量 PCR、细胞转染等技术，研究三唑磷处理后斑马鱼miR-99与与ckmt2的共表达变化、miR-99与ckmt2基因3'-UTR间的相互作用和miR-99对CKmt2蛋白表达的调控作用，旨在阐明miR-99和ckmt2在异源化学物质毒理学效应中的作用与关系。

MicroRNA(miRNA)是一类长为20~24 nt的单链非编码小分子RNA，在转录或翻译水平调控基因表达，与炎症、肿瘤等疾病的发生、发展密切相关。环境毒理学研究表明，当生物细胞或组织暴露于环境化学物质时，会引起相关miRNA的表达发生变化，进而导致其靶基因表达发生变化。因此，有必要明确环境化学物质、miRNA及其靶基因三者间的作用关系。. 我们前期的研究表明，当斑马鱼（Danio rerio）暴露于农药三唑磷后，miR-99和miR-217的表达显著下调，而miR-203的表达则显著上调。本项目以斑马鱼miR-99，miR-217和miR-03为对象，采用实时荧光定量 PCR、细胞转染等技术，研究三唑磷处理后斑马鱼miR-99与其预测靶基因ckmt2，以及miR-217和miR-203与其靶基因nup43的共表达变化、miRNA与其靶基因3'-UTR间的相互作用、miRNA对靶基因表达的调控作用，旨在阐明miR-99和ckmt2以miR-217、miR-203和nup43在农药三唑磷毒理学效应中的作用与关系。. 随着三唑磷暴露浓度的增加，斑马鱼miR-99与其预测靶基因ckmt2的表达变化未呈现规律性变化，表明ckmt2可能不是miR-99的靶基因。miR-203的表达量随暴露浓度的增加而增加，而miR-217的表达量则呈下降趋势，它们的靶基因nup43则呈上调趋势。我们利用Western Blot技术检测了nup43蛋白的表达情况，其表达量亦呈上升趋势。. 利用双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼nup43的3’-UTR区存在miR-217直接结合位点，表明nup43为miR-217的靶基因。miR-203是否能与nup43的3’-UTR区，尚不明确。当把miR-217 mimic转染到斑马鱼ZF4细胞系中后，nup43在mRNA和蛋白水平的表达都降低了；而当把miR-217 inhibitor转染到ZF4细胞系中后，其内源miR-217的表达被抑制，nup43在mRNA和蛋白水平的表达都升高。. 以上结果表明，当斑马鱼暴露于三唑磷时，miR-217可调控nup43的表达。miR-217对三唑磷毒性响应表达模式可作为其毒理学效应的生物标志物。