野生稻先天免疫系统中脂多糖相关模式识别受体的分离与鉴定

The plant innate immunity system consists of two layers of defense. The first layer of defense, induced by the sensitive perception of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs) at the plant cell surface，is named as PAMP-triggered immunity (PTI). The second layer is called effector-triggered immunity (ETI), which is induced by effector proteins of certain pathogens. PTI is the first barrier that plants resist most of pathogens, which brings more broad-spectrum and durable resistance for plants. So it is likely more worthwhile for plant protection to investigate PTI compared with ETI. The lipopolysaccharide from Xanthimonas oryzae pv. oryzicola, the pathogen causes rice bacterial leaf streak disease, can induce the plant immunoreaction as PAMP. The wild rice (Oryza rufipogon Griff) in Guangxi is rich in disease-resistent genes.Therefore, isolation, screening and identification of LPS recognition receptors and their coding genes from the wild rice is the foundation for elucidating PAMP/PRR recognition mechanisms, molecular designing of disease-resistance crops and disease-resistance transgenic breeding. In this project, based on the LPS/receptors binding affinity and the biotin-avidin system, we intend to enrich the candidate protein with immunomagnetic beads, isolate the target protein with Western blotting, identify the receptor protein and gene with the application of mass spectrometry，and finally verify the function of LPS recognition receptors coding genes by rice genetic transformation.

植物先天免疫系统包括两种抵御病原菌策略：由植物细胞表面的模式识别受体（PRR）识别病原菌相关分子模式（PAMP）激活的免疫反应（PTI）和由某些病原菌的效应蛋白激活的免疫反应（ETI）。最新研究认为，PTI是植物抵抗绝大部分病原微生物的第一道屏障，而且结构保守的PAMPs激发PTI产生的植物抗性更广谱持久，PTI研究价值很可能超过ETI。细菌性条斑病菌（Xoc）产生的脂多糖（LPS）可作为PAMP激发植物先天免疫。因此，从富含抗性资源的广西野生稻中筛选、分离和鉴定LPS模式识别受体将为PAMP/PRR识别机制研究、抗病作物分子设计、抗病转基因育种奠定物质与理论基础。项目以野生稻-Xoc为研究模式，利用LPS与受体的专一亲和性，采用免疫磁珠富集技术和蛋白免疫印迹筛选技术，筛选获得LPS相关模式识别受体，应用生物质谱技术鉴定受体蛋白质，结合水稻过量表达技术验证受体编码基因功能。

植物细胞表面的模式识别受体（PRR）感受病原菌相关分子模式（PAMP）而激活的免疫反应（PTI），是植物抵抗绝大部分病原微生物的第一道屏障。脂多糖（LPS）可以作为PAMP激活PTI。阐明脂多糖的结构及其合成基因功能、分离鉴定脂多糖相关模式识别受体，将为PAMP/PRR识别机制研究奠定基础。.为探究Xoc菌株LPS合成基因簇的功能，课题以XocGX01菌为实验材料，采用同源整合原理系统突变脂多糖合成基因簇, 获得Xoc脂多糖合成基因簇的15个单基因突变体，结果表明，其中4 个基因（XOC0798、XOC0797、XOC0795与 XOC0794）与 LPS 的合成有关；其突变菌株的多个生理生化表型、致病力以及产生的脂多糖电泳带型均发生变化。.为探究Xoc菌株脂多糖的保守结构，课题以XocGX01菌和上述4个基因突变菌株为实验材料，提取纯化LPS，采用基质辅助激光解析串联飞行时间（MALDI-TOF-TOF）质谱仪鉴定脂多糖结构，结果表明：XocGX01菌和上述菌4个基因突变株均含分子式为C52H94N2O15P的Lipid A基团，揭示不同Xoc菌株脂多糖存在相对保守的Lipid A结构区域，进一步说明上述4个基因与LPS的O抗原的形成有关。.为探究脂多糖对水稻免疫系统的影响，课题以水稻日本晴为实验材料，用GX01野生型菌株、XOC0797突变体、GX01菌株脂多糖提取物以及水压渗的水稻叶片为样本进行了水稻基因的转录组测序和分析，结果表明，在LPS对空白组对比分析中，有差异变化的基因有284个，其中167个基因上调，包括Os04g0301500、Os07g0529600、Os09g0486500等与抗病相关基因。在GX01对XOC0797突变体对比分析中，发现有相当数量的与氧暴相关的基因下调，说明LPS与植物诱导抗性的产生有关，而GX01有可能压制寄主的基础抗性。.为发现和鉴定脂多糖识别受体，课题以水稻日本晴为实验材料，采用基于LC-MS/MS的多维蛋白质鉴定技术（MudPIT），对水稻总蛋白质进行了大规模鉴定，共鉴定8072个专一性肽段，对应于1816种蛋白，构建了开源的水稻蛋白质表达谱数据库。经生物信息学分析，发现了一批与病原菌互作、压力应答有关的重要蛋白质候选物和蛋白质互作事件，这些为继续筛选发现LPS识别受体奠定了基础。