狗牙根脱水素基因CdDHN4的抗旱功能及分子调控机制研究

Freshwater resource in our country is very deficient, which limits the development of urban afforesting and greening espicially the lawn construction. Cloning drought-tolerance gene from plants, transforming them to turf to enhance turfs' tolerance, and cultivating new drought-tolerance varieties are the basic way to advance lawn cause. .Dehydrin is one of the important stress-tolerance protein found in plants. It was reported that dehydrin is intimately related to stress tolerance of plants. This project is planed to clone a dehydrin gene and character its function. The gene was named CdDHN4. It was first found significantly up-regulated in a drought-tolerance genotypy of bermudagrass-'Tifway' after 10 days waterless. But in the drought-sensitive genotypy-'C299', its expression is much lower than in 'Tifway' under water stress. This is hinting CdDHN4 may relate to drought tolerant of 'Tifway'. In this project we will clone the whole CdDHN4 including its promoter, analysis its expression modle and cellular localization, and make sure that it can really enhance plant drought tolerance. We planed to use transgenic technology and RNA interference technology to confirm CdDHN4's function of drought tolerance. .With these work, we want to obtain a neval drought-tolerance dehydrin gene and make sure of its regulation pathway and reveal the molecular mechanism of drought tolerance related to dehydrin. All these work will be useful for further cultivating drought-tolerance varieties of turfs.

我国水资源严重匮乏限制了城市绿化，制约着草坪绿地的建设和高水平发展。克隆植物抗旱基因，培育抗旱草坪草新品种是推动我国草坪发展水平的根本途径。脱水素是植物中发现的一种重要抗逆蛋白，与植物的抗旱能力密切相关。申请人所在研究组在研究八个不同狗牙根品种的抗旱性能时发现，脱水素蛋白与狗牙根抗旱有着密切关系，其中一脱水素基因与大麦脱水素蛋白DHN4基因相似性极高。本课题拟从抗旱的狗牙根中克隆脱水素基因CdDHN4，并对该基因的表达调控，细胞定位及抗旱功能进行分析。主要研究内容包括：CdDHN4基因cDNA全长的克隆；启动子克隆；CdDHN4基因组织表达和诱导表达分析，CdDHN4细胞定位及CdDHN4基因的抗旱功能分析，以期获得一个新的、具有明显抗旱功能的脱水素基因，明确其表达模式及基因的调控通路，为进一步研究脱水素基因参与抗旱的生理和分子机制、培育抗旱草坪草新品种奠定基础。

脱水素是植物中发现的一种重要抗逆蛋白，与植物的抗逆能力密切相关。本项目通过RACE技术，成功从Tifway与C299两个狗牙根品种中分别得到两个CdDHN4基因的mRNA序列（称为CdDHN4-L; CdDHN4-S）。ProtParam和Cell-PLoc 2.0软件分析发现CdDHN4蛋白是一个亲水性蛋白，定位于细胞质中。分别与大麦、小麦等六种禾本科植物的脱水素基因进行蛋白序列比对发现两基因属于YSK2型脱水素家族。在进化关系上与无芒隐子草的脱水素基因的亲缘关系较近。基因组步移的方法发现在Tifway基因组上仅含有一个CdDHN4 基因序列，以翻译起始密码子ATG为+1，在基因的300bp位置处有一个内含子，CdDHN4-L和CdDHN4-S基因的不同处在于360bp位置存在可变剪切位点。上海交通大学沈红斌蛋白预测平台分析确定CdDHN4-L和CdDHN4-S基因的可能功能包括：1，脱水素的普遍功能---分子伴侣功能；2，保护和促进细胞内的蛋白翻译功能。.基因组步移方法克隆得到Tifway CdDHN4基因启动子序列，全长1242bp。植物顺式元件数据库plantCARE和数据库PLACE分析发现CdDHN4的启动子含有ABRE、MBY和MYC应答元件这三个在依赖于ABA信号途径中所必须的顺式元件。推测，狗牙根脱水素基因的表达依赖于ABA信号途径。烟草叶片的瞬时表达实验和激素喷施实验进一步证明了该基因受ABA通路调控。.将Tifway植物体内克隆的CdDHN4-L和CdDHN4-S基因全长分别转化拟南芥和大肠杆菌，发现CdDHN4-L和CdDHN4-S基因的多种抗性功能。原核表达分离和纯化出蛋白后，实验确定了CdDHN4-L和CdDHN4-S蛋白的分子伴侣功能。它们能够保护酶和蛋白经受逆境仍具有很高的活性。.本项目从蛋白功能分析的角度入手对脱水素基因抗逆功能的分子机制进行研究，对深刻认识脱水素在植物抗逆方面的作用机制具有重要的理论价值。CdDHN4 基因编码的蛋白，可保护其他蛋白和酶的活性。其应用价值不仅在植物研究、基因工程技术开发而且在未来的医药探索方面都将具有极好的开拓前景。