几种典型环境污染物小分子适配体的亲和性能表征及酶联变构适配体检测方法的构建和应用

Rapid, sensitive and high throughput detection of environmental pollutant small molecules is highly demanded for screening environmental pollutant small molecules and assessment of their toxic effect. As an artificial affinity ligand with specific recognition capability, nucleic acid aptamers show advantages in analysis of environmental pollutant small molecules, such as easy preparation, easy labeling, and low cost, and etc. This project focuses on the research about aptamers of a few typical environmental pollutant small molecules (e.g. persistent organic pollutants and endocrine disruptors). We apply microscale thermophoresis and other techniques for molecular interaction analysis to make thorough affinity characterization of these aptamers for environmental pollutant small molecules, optimize the aptamer sequences, and investigate experimental conditions having important effects on affinity interactions. On the basis of affinity characterization, we develop enzyme-labeled structure switching aptamer based assays for rapid and sensitive detection of environmental pollutant small molecules, including optical detection format and electrochemical detection format. In this assay, the binding of target molecule competitively changes the hybridization of enzyme-labeled aptamer and complementary sequence attached on the solid support, leading to changes of signals from enzymes. This enzyme-labeled structure switching aptamer based assay takes advantage of the unique property of target-binding induced aptamer structure switching and enzyme catalysis reaction for signal amplification.

环境污染物小分子的快速、灵敏、高通量检测在环境污染物筛查和毒理评价等方面有重要的需求。核酸适配体作为一种人工合成的具有特异识别能力的亲和配体，在环境污染物小分子的检测方面具有优势，如易制备、易标记、和低成本等特点。本项目围绕几种典型环境污染物小分子（如持久性有机污染物和环境内分泌干扰物分子）的核酸适配体开展研究，利用微量热泳动技术等相互作用分析技术全面表征核酸适配体的亲和性能，优化适配体序列，并考察对亲和作用有重要影响的实验条件。在亲和性能表征的基础上，我们发展基于酶联变构适配体的新型分析传感法用于灵敏快速检测环境污染物小分子，包括光学检测模式和电化学检测模式。目标分子与适配体的结合，竞争性地改变酶联适配体与互补序列在固相基底上的杂交，从而导致酶分子信号的变化。这种酶联变构适配体法发挥了目标分子结合诱导的适配体结构变化的特性和酶分子催化反应放大信号的优势。

在项目的资助下，针对环境污染物小分子的分析检测需求，我们围绕几种环境污染物小分子的适配体开展了研究，表征了适配体和目标小分子的亲和作用，并发展了基于适配体变构和酶分子标记的分析传感方法。利用等温滴定量热技术等相互作用分析技术我们系统表征了双酚A等适配体的亲和特性。我们发现双酚A的适配体具有较好的亲和力，我们细致考察了双酚A适配体的亲和力影响因素，包括序列、溶液中金属离子、温度等，并推测出了双酚A适配体的二级结构。根据双酚A适配体等，利用适配体变构特性，我们发展了多种光、电传感分析方法，包括荧光开关和电化学开关等，方法具有较高灵敏度和选择性。我们进一步发展了酶联变构适配体分析方法。我们将短链互补核酸修饰到微孔板表面，将辣根过氧化物酶（HRP）分子标记到适配体末端。在目标分子不存在时，短链互补核酸与HRP标记的核酸适配体互补杂交形成双链结构。HRP分子催化相应的底物，生成产物，产生检测信号。目标分子存在时，HRP标记的核酸适配体与目标分子结合，不再与微孔板上的短链核酸杂交，因此微孔板上HRP标记的核酸适配体量减少，相应的检测信号减小。这种方法具有高灵敏度，可实现多种小分子的灵敏检测。所发展的方法在环境分析、食品安全等领域具有应用前景。在项目资助下，已发表论文22篇，其中SCI论文21篇，发表在Analytical Chemistry、Biosensors Bioelectronics、ACS Sensors等期刊上，获得授权专利3项。