基于石墨相氮化碳复合材料的CTCs电化学快速检测方法研究

For now, there are very limited methods for the clinical detection of circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood. The situation cannot satisfy the demand of clinical diagnosis and treatment. This study intends to solve the problems of CTCs determination with electrochemical methods, which has the advantages such as economical, rapid and so on. In the preliminary research, the applicant have systematically studied a green material of graphite carbon nitride (g-C3N4), which is an economy and bio-affinity material and proved as an ideal candidate for fabricating electrochemical bioassay method. Here, combined with the unique material structure of g-C3N4, the applicant intends to improve chemical cleavage, photo-catalysis and other material modification methods to controllably prepare g-C3N4/metal nanoparticle composite. On this basis, the composite is used as the key component for capturing and recognizing CTCs. Meanwhile, an ion sensing channel would be built on the surface of the composite modified electrode, and metal ion would work as the messenger molecule to establish a sensitive, fast and specific CTC electrochemical detection method by simulating the biological immune response process. Moreover, a signal recognition system based on the specific surface antigen of CTCs would be fabricated to classify CTCs preliminarily. Finally, this study aim to provide some ideas for the routine application of peripheral blood CTCs detection during the clinical diagnosis and treatment.

目前，外周血循环肿瘤细胞（CTCs）检验手段十分有限，无法满足临床诊疗过程中的需求。本项目拟用经济、快速的电化学方法解决CTCs检验技术难题。在前期工作中，申请人对绿色经济、生物亲和性良好的石墨相氮化碳（g-C3N4）进行了系统研究，证明其是构建电化学生物检测方法的潜在理想材料。在本研究中，申请人拟利用g-C3N4的特殊材料结构，改进化学剪裁、光催化等材料修饰、复合技术，深入研究石墨相氮化碳/金属纳米颗粒复合材料的可控制备方案并探讨相关机理。在此基础上，以复合材料作为执行捕捉、识别CTCs的核心功能元件，在电极表面搭载离子传感通道，以金属离子为信使分子，通过模拟生物免疫应答过程，建立灵敏、可靠、特异性高的CTCs快速检测方案。同时，建立特异性CTCs表面抗原响应信号识别体系，对外周血中的CTCs进行初步分型，为最终实现外周血CTCs检测在临床诊断、治疗中的常规化应用提供思路。

目前，临床实验室中使用的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）捕获和检测方法大多仍然依赖于对肿瘤细胞表面特异性表达蛋白的识别，但是作为经典识别工具的蛋白质抗体往往具有稳定性差、价格昂贵等缺点。本课题使用核酸适配体替代蛋白质抗体作为识别和捕获CTCs的媒介。为了提高长链适配体在磁珠表面的修饰和识别效率，本课题将适配体相关序列纳入到DNA纳米四面体的刚性结构中，合成了修饰有DNA四面体的CTCs磁分离工具。藉由DNA四面体特殊的三维结构，该磁分离工具可以同时将两种不同的CTCs表面特异性表达蛋白作为识别靶点。另一方面，本课题利用适配体寡核苷酸分子链易于编辑修饰的特点，将两种不同的适配体设计成为选择性启动杂交链式反应（hybridization chain reaction, HCR的）分子开关。在两种适配体同时识别细胞表面靶点后启动HCR反应，通过大量含有特殊识别序列的核酸扩增产物，激活CRISPR/CAS系统的核酸内切酶活性，实现对CTCs的测定。由于CTCs从原发部位迁移至远端定植的过程中将经过多个转化过程，患者外周血中会同时存在多种亚型的CTCs，而各个亚型之间的临床意义差异较大，细胞形态和表面特异性表达蛋白的种类也不尽相同，同时修饰有多种适配体的磁分离工具和适配体选择性分子开关装置有利于实现对不同亚型CTCs的分离和检测。同时，本课题还尝试在使用分子诊断技术的基础上，联合RT-PCR技术探索CTCs的高通量、快速检测方法。最终，本项目资助的研究内容将为实现外周血CTCs分型检测在临床诊断、治疗中的常规化应用提供思路。