基于流感病毒非结构蛋白NS1特性的金柴抗病毒胶囊作用机理研究

明确抗病毒药物作用的上游机制或始动环节，是科学阐释中药复方抗病毒作用机理的必由之路，也是在新时期发挥中医外感病理论为流感治疗提供有效方法的重要手段。.本研究在明确中药复方金柴抗病毒胶囊治疗流感作用的基础上，以流感病毒感染过程中发挥重要作用的非结构蛋白NS1为核心，针对其与细胞核内CPSF30结合而干预机体系列抗病毒细胞因子合成这一特性，采用酵母双杂交与免疫共沉淀相结合的方法，对两者的相互作用进行研究。首先通过建立酵母双杂交系统，确定该药对NS1和CPSF30基因结合的影响，再运用免疫共沉淀方法，在真实细胞内检测NS1/CPSF30蛋白复合物水平，进而明确药物对两种蛋白结合的干预效应，探索该药抗病毒作用的上游机制或始动环节。.本研究可建立针对NS1与CPSF30结合环节进行抗病毒研究的相关技术，为其它中药复方抗病毒机制研究提供新的思路与方法。

本研究按原计划书要求，完成了全部实验内容。并增加了药物化学与网络药理学内容，明确了中药复方抗病毒作用机理、物质基础及相关机理。主要研究包括：.1、.金柴抗病毒胶囊对流感病毒非结构蛋白NS1与CPSF30结合作用的影响。.以流感病毒感染过程中发挥重要作用的非结构蛋白NS1为核心，针对其通过与细胞核内CPSF30 结合而干预机体系列抗病毒细胞因子合成这一特性，建立酵母双杂交系统（yeast two hybrid system,Y2H），并选用金柴抗病毒胶囊原药、水部位，30%、60%及95%部位，及方中4种主药中的绿原酸、黄芩苷、柴胡皂苷、连翘苷、连翘脂苷等1中成分，对NS1蛋白与CPSF30结合的作用进行研究。研究结果显示，黄芩苷、连翘酯苷及金柴抗病毒胶囊95%部位对NS1蛋白与CPSF30的结合有明显的拮抗作用，IC50分别为：黄芩苷：262.8μg/mL；连翘脂苷： 59.43μg/mL；金柴抗病毒胶囊95%部位：45.76μg/mL。此后，为避免Y2H的假阳性，研究进一步采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）的方法在293T细胞内检测NS1/CPSF30 蛋白复合物水平，结果显示金柴抗病毒胶囊95%部位对NS1蛋白与CPSF30的结合确实具有拮抗作用。证明金柴抗病毒胶囊确实具有抗病毒作用，其抗病毒作用机理是通过影响流感病毒非结构蛋白NS1与CPSF30结合而发挥作用。.2. 中药复方抗病毒作用物质基础与相关机理研究.考虑到中药复方成分复杂、作用广泛的特点，为明确抗病毒作用的物质基础及潜在的抗病毒作用机制，在完成原有计划的同时，我们增加了两部分内容：1.药物化学研究：建立金柴抗病毒胶囊HPLC色谱图，并对复方有效部分的指纹图谱进行初步分析，分析显示黄芩苷与绿原酸为金柴抗病毒胶囊中主要成分。同时结合文献及IPA（Ingenuity Pathway Anaylsis）检索选择柴胡皂苷、连翘苷、连翘脂苷，并制备原药及复方不同部位（原药液、水部位、30%部位、60%部位、95%部位）用于正式实验。2. 网络药理学研究：利用网络药理学方法对复方主要成分抗病毒作用通路与甲流发病机制进行分析。研究显示，金柴胶囊还可能通过影响甲流中对外部刺激反应引起的线粒体凋亡，通过NFKB、CASP等信号路径调节凋亡而发挥抗病毒作用。