线粒体融合功能障碍在氯胺酮干扰发育期海马神经干细胞增殖与分化中的作用及机制研究

The mechanism of ketamine induced developing neurotoxicity is not completely understood. Our previous findings suggested that clinically relevant doses of ketamine disturbed the proliferation and differentiation of hippocampal neural stem cells (NSCs) by suppressing Ca2+/PKCα signaling pathway and induced the adult neurocognitive dysfunction. Mitochondrial dynamics had been confirmed to play an important role in regulating the proliferation of NSCs in the developing cortex and the cognitive function during adult stage. In the relevant preliminary experiment, we found that ketamine could reduce the expression of mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) in the hippocampal NSCs isolated from neonatal mice and lead to mitochondrial fusion dysfunction. Therefore, the project will use behavioral testing, molecular biology, gene overexpression mice and other methods to verify the role of mitochondrial fusion dysfunction in the neonatal ketamine exposure impaired the proliferation and differentiation of hippocampal NSCs and the adult cognitive function from the animal, cellular and subcellular levels. The mechanism of Ca2+/PKCα signaling pathway affecting MFN2 expression will also need to be clarified. This study will reveal the new mechanism of ketamine induced developing neurotoxicity from the perspective of mitochondrial dynamic of NSCs and provide a new strategy for the prevention of developing neurotoxicity of general anesthetics in clinical practice.

氯胺酮致发育期大脑神经毒性的机制尚不完全清楚。我们的前期研究结果提示：临床相关剂量氯胺酮通过抑制Ca2+/PKCα信号通路进而干扰发育期海马神经干细胞（NSCs）增殖与分化并损伤成年阶段的认知功能。近年来，线粒体动力学被证实在调控发育期皮层NSCs增殖及成年阶段认知功能形成中发挥重要作用。我们在相关预实验中发现：氯胺酮可降低新生小鼠海马NSCs线粒体融合蛋白2（MFN2）的表达水平，并导致线粒体融合功能障碍。因此，本项目拟利用行为学、分子生物学、构建基因过表达小鼠等手段，从整体、细胞及亚细胞水平揭示线粒体融合功能障碍在氯胺酮损伤发育期海马NSCs增殖、分化及成年阶段认知功能中的作用，并阐明Ca2+/PKCα信号通路影响海马NSCs中MFN2表达的机制。本项目将从NSCs线粒体动力学这个新视角揭示氯胺酮致发育期大脑神经毒性的可能机制，为临床中寻找预防全身麻醉药发育期神经毒性的策略提供新思路。

背景:氯胺酮诱发神经毒性的机制尚未完全阐明。最近的研究表明，线粒体融合/裂变动力学在调节神经发生中起着关键作用。因此，本研究的目的是评估线粒体动力学是否参与氯胺酮诱导的新生大鼠神经发生损伤和长期突触可塑性功能障碍。.研究内容:出生后第7天(PND-7)雄性大鼠腹腔注射氯胺酮40 mg/kg，连续注射4次，间隔1 h。Western blot检测海马齿状回（DG）中线粒体裂变相关蛋白(Drp1)和线粒体融合相关蛋白(Mfn1和Mfn2)的表达。我们发现氯胺酮麻醉后Mfn2蛋白表达降低。在体外研究中，用100µM氯胺酮处理海马神经干细胞（NSCs） 24 h，观察Mfn2表达情况。在干预性研究中，在氯胺酮给药前4天，将过表达Mfn2 (LV-Mfn2)的慢病毒(LV)微量注射到海马DG。采用Western blot、免疫荧光染色、免疫电镜和透射电镜检测NSCs中Mfn2相关线粒体融合的变化。采用免疫荧光双标染色检测海马NSCs的增殖和分化情况。在2月龄时，采用Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆功能。在行为测试结束后24 h，通过透射电镜、高尔基-考克斯染色和长期增强(LTP)记录评估突触可塑性。.结果:体内及体外实验均显示，氯胺酮通过下调Mfn2的表达诱导海马NSCs线粒体融合功能障碍。DG区微量注射LV-Mfn2，可恢复NSCs线粒体融合功能，逆转氯胺酮对NSCs增殖的抑制作用及其对神经元分化的促进作用。此外，LV-Mfn2预处理通过逆转氯胺酮对海马DG突触可塑性的干扰作用，改善了新生儿重复氯胺酮暴露后的长期认知功能障碍。.结论:目前的研究结果表明，Mfn2介导的线粒体融合功能障碍通过干扰海马神经发生，在新生期重复氯胺酮暴露引起的长期神经认知功能和突触可塑性损害中起关键作用。Mfn2可能是预防氯胺酮发育性神经毒性的一种新的治疗靶点。