基于序列差异和甲基化的菊花花色变异分子机理

Chrysanthemum is a famous ornamental plants with rich germplasm resources and variation of flower color. Bud mutation is the main reason for the color diversity, but the regulation mechanism of bud mutation of chrysanthemum is still unknown. Anthocyanidins and carotenoid are the main pigments that lead the flower color of chrysanthemum. It is proved that the regulation of these pigments is relevant to sequence variations and DNA methylation. We have got a series of bud mutations of chrysanthemum ‘Jianliuxiang’, including white, yellow (accumulate carotenoid only), pink(accumulate anthocyanidins only) and red (accumulate both pigments). On the basis of transcriptome analysis of these mutations, in this study, we will select the key genes which regulate the pigments pathways used gene expression analysis technology, the DNA sequence and promoter region will be isolated for analyzing the correlation between the sequence variations (Indel, SNP, transposon insertion and alternative splicing) and gene expression of the key genes. The dual luciferase assay, promoter deletion analysis, yeast one-hybrid assay, transgenic technology will be further used for the analysis of their function. Methylation levels of these genes will also be investigated to understand molecular mechanism for coloration unrelated with the sequence variations from epigenetics perspective.The research will clarify the regulation mechanism of flower color variations of chrysanthemum, and provide possibility for flower color directional breeding.

菊花品种资源丰富，花色多样，芽变是其花色多样性的重要来源。但芽变产生的方式及其调控花色形成的分子机理尚不明确。花青素和类胡萝卜素是决定菊花呈色的重要色素物质，分子遗传学研究表明，序列变异和甲基化是调控两类色素代谢的重要机制。课题组前期获得了一系列稳定的菊花花色芽变突变体，包括兼六香系列的白、黄（含类胡萝卜素）、粉（含花青素）和红色（两者兼有）品种。本申请在进行了上述品种转录组测序的基础上，首先通过基因表达分析获得两类色素代谢的节点基因，继而分离其DNA和启动子序列，找出序列变异（插入缺失、SNP、转座子、可变剪接等），通过序列删截与活性分析、酵母杂交、双荧光素酶实验、转基因等技术研究序列变异调控节点基因转录的机理。对于非序列差异引起的基因表达差异，进行启动子区甲基化检测，从表观遗传角度解释菊花花色芽变突变体形成的机理。研究成果有助于阐明菊花花色变异的分子调控机制，为定向改良其花色奠定基础。

花色是菊花最重要的观赏性状，花青素和类胡萝卜素是决定菊花呈色的重要色素物质，但调控这两类色素代谢的关键基因及其调控机理尚不明确，本项目从生理生化、细胞超微结构、转录组学和序列差异等层面系统的解析了菊花花色突的原因。以‘兼六香’菊系列突变体的白、粉、黄和红色品种为材料，发现菊花中花青素代谢相对简单，主要积累Cy 3-O-(6″-O-malonylglucoside) 和Cy 3-O-(3″,6″-O-dimalonylglucoside，在白色和黄色品种中不积累，而粉色和红色中积累含量较多。类胡萝卜素代谢较为复杂，主要包括紫黄质、叶黄素及β-胡萝卜素，存在于前质体和未成熟的叶绿体中，随着头状花序的发育，白粉品种中的叶绿体发生降解，而前质体并未发生转化，仅产生了囊泡结构（vesicle），积累微量的类胡萝卜素；而黄色和红色品种中的前质体和叶绿体都转化成有色体结构，积累叶黄素、叶黄素的同分异构体及叶黄素的衍生物。继而利用比较转录组学结合基因表达分析发现，CmMYB40是决定菊花花青素合成的关键调节基因，转基因及双荧光素酶实验均证明其能够驱动下游结构基因CmCHS2、CmDFR、CmANS的高丰度表达，在舌状花中积累大量矢车菊色素的衍生物，序列比对及启动子活性分析发现，粉色和红色品种中该基因启动子出现序列变化，能够高效驱动GUS蛋白的表达。类胡萝卜素方面，参与有色体转化有关的CmPg-1、CmOr、CmPAP10、CmPAP13及降解途径基因CmCCD4a在四个色系间差异表达显著，利用WGCNA方法还筛选到了6个与菊花类胡萝卜素相关的转录因子：CmMYB305、CmMYB29、CmRAD3、CmbZIP61、CmAGL24、CmNAC1，其通过调控代谢及与质体发育相关结构基因的表达从而影响菊花类胡萝卜素的积累。序列比对分析发现，CmOr存在多个转录本的可变剪切成员，通过依托本项目建立起的菊花VIGS体系，对多个CmOr剪切体进行了叶片中的内源沉默，发现了其中最为重要的序列成员CmOr3。.我们的研究结果初步解析了基于序列差异的菊花花色变异机理，获得的节点基因及关键元件是进行观赏植物花色转基因育种重要的基因资源。