从海马神经干细胞的增殖与分化机制探讨肝肾藏泄互用关系的实质

中医药自主创新与发展的关健环节在于对传统中医学理论的解读与创新，中医藏象理论是中医学理论体系的核心内容。细胞是人体的最小功能单位，是人体一切外在生命现象最基本的物质基础。本课题在前期研究的基础上，以中医肝肾两脏的主要生理功能及相互关系为切入点，把中医先天之精理论与现代干细胞理论联系起来，在中医"肝肾同源、藏泄互用"的理论指导下，提出"在干细胞层面，肾主藏精的功能主要表现为干细胞的储备与增殖，肝主疏泄的功能主要表现为促进干细胞分化"的假说。并进一步采用现代生物学实验技术，通过动物实验及体外细胞培养实验研究方法，结合干细胞研究最新进展，探讨调肝治法与补肾治法影响大鼠海马神经干细胞增殖、分化的作用机制。从细胞层次探讨肝肾二脏"藏泄互用"关系的实质，为传统中医藏象理论的创新与发展提供新的思路和实验依据。同时也为调肝与补肾治法结合干细胞技术治疗临床多种疑难疾病提供理论与实验依据。

本课题基于“肝肾藏泄互用”的理论，把中医先天之精的概念与“干细胞”联系起来，提出“在‘干细胞’层面，‘肝肾藏泄互用’的功能关系表现为促进‘干细胞’的增殖与分化”的假说。围绕这一假说分别从动物在体实验与离体培养海马神经干细胞实验两方面探讨调肝与补肾中药对大鼠海马神经干细胞增殖与分化的干预作用机制。在体实验方面：采用长期房室不节结合劳倦过度复制肾虚大鼠模型。观察补肾治法对肾虚模型大鼠的空间学习记忆能力及海马组织形态学的影响；大鼠海马DG区细胞超微结构及增殖凋亡相关蛋白表达的影响；大鼠海马DG区细胞β-catenin、Wnt1、CyclinD1和c-Myc表达的影响。采用慢性不可预知温和应激大鼠模型。观察四逆散对应激大鼠的体重，糖水消耗实验，Morris水迷宫实验的影响；大鼠海马DG区突触数量及结构变化；及海马神经干细胞增殖分化相关的wnt信号通路中β-catenin、JNK、Rho信号蛋白表达及β-catenin、wnt3a、Wnt11、wnt5a、JNK、Rho基因表达的影响。离体细胞培养实验：采用新生SD大鼠海马神经干细胞分离传代培养，通过血清药理学实验方法，观察不同剂量四逆散、六味地黄丸对新生大鼠海马神经干细胞的增殖分化的影响及其可能的作用机制。结果发现：动物实验方面，慢性应激及肾虚模型大鼠的空间学习记忆能力均出现下降，海马区神经元超微结构也发生了明显的病理性改变。四逆散与六味地黄丸可分别改善慢性应激及肾虚大鼠空间学习记忆障碍、海马DG区细胞超微结构及组织形态学病变。四逆散对wnt信号通路中的β-catenin、wnt3a、Wnt11、wnt5a、JNK、Rho基因的表达有上调作用，六味地黄丸能上调大鼠海马DG区细胞Wnt1表达，激活经典Wnt信号通路，导致胞内β-catenin大量聚集，上调下游靶基因c-Myc和Cyclin D1表达，启动靶基因转录。在体外细胞培养实验方面：六味地黄丸对体外培养NSCs增殖有明显促进的效应，可明显上调NSCs c-myc、CyclinD1 mRNA表达。四逆散与六味地黄丸均能促进体外培养NSCs向神经元分化，可上调NSCs的Wnt1、Wnt3a及β-catenin蛋白、基因表达，其促进NSCs向神经元分化作用机制可能与上调Wnt1、Wnt3a及β-catenin表达、激活wnt/β-catenin信号转导通路有关。