CD44/CD49d介导骨髓微环境庇护和MIRL抵抗穿孔素/颗粒酶杀伤途径在CAR-T细胞治疗后急性淋巴细胞白血病CD19阳性复发中的作用和机制

Patients with refractory/relapsed acute lymphoblastic leukemia (R/R ALL) are associated with very poor prognosis. Chimeric antigen receptor modified T cells targeting CD19 have potent anti-leukemia activities with a very high complete remission (CR) rate in R/R ALL (around 90%). Relapse, however, still remains to be the major problem. In our previous study for the first time we found that the sub-clone with high expression level of CD44/CD49d before CART19 therapy and clonal evolution after CART19 therapy were the 2 main causes for relapse by using single cell transcriptome sequencing. Based on these, our hypothesis is: the leukemia subclone with high expression of CD44/CD49d resides in the bone marrow niche, and escapes from CART19 cytotoxicity because of niche-protected physical barrier, hypoxia-activated PI3K/AKT pathway, and negative immune regulation from bone marrow stromal cells. Then the sub-clone will be the minimal residual leukemia cells during complete remission. Under the selection pressure of CART19 therapy, these minimal residual leukemia cells up-regulate MIRL expression which has shown to resist peforin/granzyme-mediated cell lysis. Our study tries to elucidate the above mechanisms of CD19 positive relapse after CART19 therapy which will provide expreriment evidences for CD19 positive relapse and lay the foundation for finding novel therapeutic targets.

难治复发急性淋巴细胞白血病(ALL)预后差、生存期短。靶向CD19的CAR-T(CART19)疗法是最具应用前景的靶向治疗，对CD19阳性ALL诱导缓解率约90%，但复发是治疗失败的主要原因。前期利用单细胞转录组测序首次发现治疗前高表达CD44/CD49d的亚克隆及治疗后CART19压力选择下的克隆演变是CD19阳性复发的两大原因。本项目首次围绕CART19治疗前后白血病亚克隆、骨髓微环境、克隆演变及穿孔素/颗粒酶途径等关键因素，拟应用单细胞、人源化小鼠、活体成像等手段揭示高表达CD44/CD49d亚克隆定植于骨髓龛，通过龛物理屏障、异常PI3K/AKT激活和骨髓基质细胞负向调控等逃逸CART19杀伤成为缓解期微小残留病并在CART19压力选择下上调MIRL表达以抵抗CART19的穿孔素/颗粒酶途径致复发的可能机制，为阐明CD19阳性复发的分子机理提供实验依据，为发现新的干预靶点奠定基础。

难治复发急性淋巴细胞白血病(ALL)预后差、生存期短。靶向CD19的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法在ALL中取得了巨大成功，诱导缓解率可达90%以上，然而复发成为治疗失败的主要原因。本项目从白血病细胞自身生物学特性和骨髓微环境的内外调控机制出发，在前期研究基础上，深入分析了复发过程中白血病细胞的克隆演变规律，提出了白血病亚克隆逃避CAR-T细胞杀伤的机制；解析了CAR-T细胞治疗下骨髓微环境的重塑特征及其对CAR-T细胞治疗的影响；并且围绕CAR-T细胞治疗后复发的预防展开了探索和研究，为减少CAR-T细胞治疗后复发和改善患者预后提供治疗新思路。取得重要成果如下：.1.通过对CAR-T细胞治疗后难治复发的B-ALL患者不同时期外周血和骨髓样本的单细胞转录组测序和全外显子测序，描绘了白血病细胞在治疗前后以及复发过程的克隆演变规律，定义了“抵抗CAR-T细胞杀伤的白血病亚克隆”，该白血病亚克隆高表达粘附分子CD44/CD49d，对CAR-T细胞杀伤具有更强的抵抗能力；呈现MIRL/SERPINE1/GSDMB基因异常表达的穿孔素/颗粒酶途径抵抗特征；存在转录因子ZNF717、NBPF1、MYB的高频突变，是导致复发的重要原因。.2.建立了CAR-T细胞治疗模型以及骨髓微环境研究系统；明确了粘附分子CD44/CD49d对于白血病细胞在骨髓中定植的关键作用；首次发现和鉴定了骨髓中由CAR-T细胞治疗诱导的保护性间充质干细胞(MSC)龛结构；揭示了MSC通过Galectin-9/TIM3途径介导的对CAR-T细胞的免疫抑制作用机制。.3.研究了MIRL过度表达在白血病耐受CAR-T细胞杀伤中的作用；深入探究了CAR-T细胞功能的调控机制：证明了钙离子信号相关SOCE-Calcineurin-NFAT通路通过控制糖酵解来调节CAR-T细胞的耗竭和分化；发现了Mek抑制剂曲美替尼可有效地限制CAR-T细胞的耗竭和终末分化。.4.针对CAR-T细胞治疗后复发的关键问题，创建了CAR-T细胞联合半相合造血干细胞移植新策略，有望改善患者预后，预防白血病复发。.5.发表SCI论文22篇，其中影响因子10分以上3篇；在国际会议发表特邀报告、口头报告10次；培养博士、硕士研究生13名，获得2020年浙江省科学技术进步奖一等奖。