人血管内皮细胞登革病毒候选受体- - 55 kDa蛋白的鉴定

Dengue disease that caused by dengue virus (DENV) is a steadily worsening health problem in the tropical and subtropical areas of the world. DENV can result in a spectrum of clinical symptoms from dengue fever to dengue hemorrhagic fever / dengue shock syndrome (DF, DHF / DSS)，and no therapy or effective vaccines are available at present. The binding of virus to a surface receptor of the sensitive cell is the first step for viral infection. Many researches show that human vascular endothelial cells (VECs) are the main target for DENV infection. However, the exact molecules that afford DENV entry into the VECs have not been clarified yet. This research is based on a newly identified DENV receptor candidate molecule (55 kDa protein) on VEC suffer, screened by a modified virus overlay protein blot assay (VOPBA). In this proposal,we plan to purify the candidate protein by two-dimensional electrophoresis, and determine its coding sequence by N-terminal sequencing and mass spectrometry. Then we prepare the candidate protein in large amounts through recombinant technology for generating antibody. After that, using Co-IP and the receptor remodeling experiment, we would like to confirm the newly discovered protein as a DENV receptor. Finally,the functional domains of this receptor will be determined through a pull-down assay with a serious trancated recombinant candidates. Our work may lay down a great foundation for further understanding of dengue pathogenesis, developing the receptor-specific antagonists that would apply in control of DENV infections.

登革病毒(dengue virus, DENV)是引起登革热、登革出血热/登革休克综合征(DF, DHF/DSS)的元凶，广泛流行于热带和亚热带地区，严重危害人类健康，但目前对其所致疾病既无特异治疗手段也无有效疫苗预防。病毒与敏感细胞表面受体结合是发生病毒感染的第一步。研究表明，人血管内皮细胞（VEC）是登革感染的重要靶细胞，但该细胞上DENV受体迄今尚未阐明。本研究在前期用改良的病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）筛选出人VEC上新的DENV受体候选分子（55 kDa蛋白）基础上，拟采用2D电泳进一步分离候选蛋白，经N-端测序和质谱分析确定其编码序列，再进行候选蛋白的表达和抗体制备，Co-IP和受体重塑实验鉴定这一新发现的DENV受体，最后通过Pull-down实验对新鉴定受体的功能区进行定位。为深入认识登革致病机理、研发受体特异性阻断剂，进而控制DENV感染和流行奠定坚实基础。

登革病毒(dengue virus, DENV)是引起登革热、登革出血热/登革休克综合征(DF, DHF/DSS)的元凶，广泛流行于热带和亚热带地区，严重危害人类健康，但目前对其所致疾病既无特异治疗手段也无有效疫苗预防。病毒与敏感细胞表面受体结合是发生病毒感染的第一步。研究表明，人血管内皮细胞（VECs）是登革感染的重要靶细胞，但该细胞上DENV受体迄今尚未阐明。鉴定VECs上DENV受体或效应分子对研究DENV感染性疾病的发病机制有着非常重要的作用。本研究鉴定和特征性描述了前期用改良的病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）筛选出人VECs上一个新的DENV受体候选分子（55 kDa蛋白），这个蛋白来源于ECV304细胞质膜蛋白，可与作为DENV受体识别区的包膜糖蛋白III区（EDIII）高度亲和。质谱鉴定表明，筛选到的55 kDa蛋白是细胞波形蛋白，一种保守的细胞骨架蛋白，但可特异性表达在VECs表面。免疫共沉淀实验进一步证实DENV与波形蛋白可在体外相互结合；间接免疫荧光和激光共聚焦实验证实VECs表面的波形蛋白可与DENV在细胞表面共定位。此外，波形蛋白结合酶联免疫吸附实验和用波形蛋白纯化蛋白及其抗体进行的竞争封阻实验证实，波形蛋白中部区在DENV吸附VECs过程中发挥了重要作用。最后，我们构建了一个波形蛋白中部区蛋白和DENV-2 EDIII蛋白的对接复合物模型，并预测了其相互作用的功能残基。这些研究表明，VECs上表面表达的波形蛋白，特别是其中部区域，介导了DENV-2的吸附；细胞表面表达的波形蛋白可能作为一个新的共受体或结合分子参与DENV感染VECs，并可作为一个潜在的治疗靶点对抗DENV感染。