登革病毒进入血管内皮细胞分子机制的研究

Infection by dengue virus (DV) can cause dengue fever (DF) and severe DF（sDF）, which is a more severe, sometimes lethal disease including dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). The plasma leakage and bleeding induced by increased vascular permeability are main clinical characters of sDF. However, the factors involved in the increased vascular permeability caused by DV infection are not understood. Vascular endothelial cells (VECs) are major components in maintaining micro-vascular permeability and also act as one of DV target cells. Previously we have found that integrin β3, which distribute largely on the surface of VECs, was associated with the entry of DV2 into VECs. Therefore, to further investigate the mechanism invovled in the interaction between DV and VECs mainly focusing on role of integrinβ3 during the viral entry, the following experiments will be performed in this study: (1) screening main viral proteins interacting with integrin β3; (2) using virus-like particle(VLP) of DV to investigate the interaction between structural proteins and integrinβ3 as well as its correlaion with DV serotypes; (3) based on expressing different domains of E protein, investigating interaction between major domain(s) of E protein and integrinβ3; (4) using synthetic peptides, investigating its inhibitory effect on viral entry into host cells to determine binding sites between peptides of E protein and integrinβ3. The results from this study will be available for further clarifying occurrence of sDF and for development of anti-viral drug.

登革病毒（DV）感染引起的重症登革热（sDF）是威胁患者生命的急症，其主要临床特点是微血管通透性增加引起出血和休克。血管内皮细胞（VECs）是维持微血管完整性的重要组分，也是DV的靶细胞之一。但DV感染VECs引起通透性增加的机制尚不清楚。以往我们已证明：VECs表达的整合素β3能够与DV相互作用，介导DV进入的同时，参与VECs通透性的调控。为此本项目拟：（1）明确与整合素β3相互作用的主要病毒蛋白；（2）利用DV1-4的假病毒颗粒，研究包膜结构蛋白与整合素β3的相互作用及其与血清型的关联；（3）表达、纯化包膜E蛋白的3个功能区，检测其与整合素β3的亲和力，确定其相互作用的结构域；（4）设计并合成小分子肽，研究其与整合素β3的亲和力和阻断感染的作用，确定E蛋白与整合素β3的作用位点。为阐明DV感染所致的sDF发生机制和靶向抗病毒药物的研发提供重要实验依据。

由登革病毒（DENV）感染引起的以出血和休克为主要临床特点的重症登革是登革热的主要威胁，但其感染血管内皮细胞的机制不明。已知整合素是重要的细胞外基质蛋白，其中的β1和β3是内皮细胞表达最为丰富的表面受体，对维持毛细血管完整性至关重要。且整合素β3能够介导病毒进入宿主细胞。为此，本课题研究了整合素β3作为DENV感染内皮细胞受体的可能性。所得主要结果和结论如下：（1）DENV2感染可上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）整合素β3的表达，E蛋白是病毒与整合素β3互作的主要蛋白分子。（2）与整合素β3互作位点主要位于E蛋白的DⅢ的C333-V347（P4）和G381-K394（P7）区段，其亲和力为分别为1.40e-8M和2.28e-6M。（3）多肽P4和P7课阻断DENV2进入HUVEC，其半数抑制浓度（IC50）分别为19.08±2.52μM和12.86±5.96μM； 联合使用P4和P7对病毒进入的抑制作用无明显增强，提示P4和P7可能利用共同的作用位点，通过直接与宿主细胞互作达到抑制病毒进入的目的。另外，P7对DENV1的进入有显著的抑制作用，而P4则无，提示多肽P7可能有一定广谱的抗DENV作用。氨基酸置换后的突变多肽与整合素的亲和力较野生型多肽无明显改变，提示多肽P4和P7与整合素β3间的互作可能为特异性的抗原抗体结合，而非静电吸引。（4）其它血清型DENV的E蛋白与整合素β3几乎无亲和力检出，提示各血清型DENV感染HUVEC的机制可能不同，这一结果部分揭示了DENV2感染易引起重症登革的原因。（5）源于DENV2包膜E蛋白的其它多肽对病毒进入HUVEC影响存在多样性，提示不同多肽在DENV感染HUVEC过程中的作用不同，其机制有待进一步研究。总之，本研究明确了DENV2可能通过与整合素β3相互作用感染HUVEC，其结合位点位于EDⅢ蛋白的C333-V347和G381-K394区域。针对该区段合成的多肽可通过阻断病毒与整合素β3的结合，抑制DENV的进入。该研究为深入阐明DENV的致病机制提供重要的实验证据，并为抗DENV药物的研发提供新靶点。