人3型腺病毒展示登革病毒中和抗原表位多价疫苗候选株构建

The project proposed here is to construct the multivalent vaccine against dengue virus by displaying neutralization epitopes on type 3 human adenovirus, basing on main proposer's 7 year working experiences of adenovirus's foundation and recombination research and the human type 3 adenovirus hexon antigen epitope display technology platform which formed by State Key Laboratory of Respiratory Diseases. The main content of proposed research is including of indentifying the dengue virus' neutralization epitopes, and then substituting hyper viable regions on human type 3 adenovirus by indentified 2 to 4 dengue virus' neutralization epitopes from different types. After achieved the goal of gaining the mosaic recombination adenovirus which are substituted by multiple dengue virus neutralization epitopes, we will amplify and purify the recombinated virus and then immunize animal with them, following by analyzing the immunogenicity, and evaluating the feasibility of form the new dengue virus candidate vaccine by in vitro virus neutralization assay and animal virus attacking assay. The proposed project will further improve the research on human type 3 adenovirus based epitope display platform and for the development of other virus' neutralization epitope vaccine, and particularly, for the research of vaccine against dengue virus.

本课题拟在本人近7年来腺病毒基础及重组构建技术研究经验上、利用呼吸疾病国家重点实验室研发的人3型腺病毒六邻体抗原表位展示技术平台，构建人3型腺病毒为载体的展示登革病毒中和抗原表位多价疫苗候选株。主要内容包括确定登革病毒中和抗原表位、将所确定2-4个不同型别的登革病毒中和抗原表位同时以置换式插入人3型腺病毒六邻体的多个高变区表位，以期获得同时展示多个登革病毒中和抗原表位的嵌合型重组腺病毒，并将这种嵌合型腺病毒-登革病毒中和抗原表位重组体培养增殖、纯化后免疫动物，分析其免疫原性，通过体外病毒中和试验、动物攻毒试验等评价其作为登革病毒疫苗候选株的可行性。同时进一步为完善人3型腺病毒作为表位展示疫苗载体平台及应用于其他病毒多中和抗原表位疫苗研发、以及登革病毒疫苗研发奠定基础。

本课题研究以人3 型腺病毒六邻体抗原表位为展示技术平台，目的为构建人3 型腺病毒为载体的展示登革病毒中和抗原表位多价疫苗候选株。主要研究内容包括确定登革病毒中和抗原表位、将所确定2-4 个不同型别的登革病毒中和抗原表位同时以置换式插入人3 型腺病毒六邻体的多个高变区表位，以期获得同时展示多个登革病毒中和抗原表位的嵌合型重组腺病毒，并探讨其为登革病毒疫苗候选株的可行性，同时进一步为完善人3 型腺病毒作为表位展示疫苗载体平台及应用于其他病毒多中和抗原表位疫苗研发、以及登革病毒疫苗研发奠定基础。通过研究，我们利用白纹伊蚊C6/36传代细胞系成功扩增了登革病毒I型标准株Hawaii株，II型标准株NGC株，III型H87株，并从2014年广州市发生的大规模的登革热爆发临床标本中成功分离获得11株I型登革病毒和2株II型登革病毒临床株。我们发现通过将这几个表位分别嵌入人3型腺病毒衣壳蛋白六邻体表面，可以成功构建获得I型登革热表位和2型登革热表位分别嵌入的2株衣壳嵌合型重组人3型腺病毒，经免疫动物后检测分析其免疫应答。结果发现几个表位均能诱导出登革热表位特异的抗体应答，但是体外中和实验表明抗血清不能中和野生型登革热病毒。在此发现的基础上，我们尝试将多个血清型登革热病毒的抗原表位基因融合在一起后插入人3型腺病毒E3区，构建转基因表达载体，初步结果表明这种重组病毒可以在小鼠体内诱导出登革热病毒特异的抗体应答，并有一定的中和活性。本课题在腺病毒载体方面，用嵌合人7型腺病毒HVR5表位的重组人3型腺病毒MH5作为免疫原，制备获得多株抗HVR5表位并对HAdV7病毒有高中和活性的单克隆抗体，发现并证明HAdV7-HVR5表位为构象性表位。同时获得了3株抗HAdV3的中和活性单克隆抗体，并用表位置换型重组腺病毒和重组表达多肽证明这三株单抗识别HVR4表位。这些高滴度中和单抗及识别的表位的确定为人腺病毒感染的抗体药物研制提供基础，并扩展了人3型腺病毒表位展示载体的应用范围。本课题的研究进一步证实了利用嵌合型重组腺病毒的方式将登革病毒的中和位点展示的可行性，在针对登革病毒疫苗的研究方向上更近了一步。