蚊与登革病毒E蛋白相互作用-蚊受体分子的鉴定及其功能研究

目的：研究蚊与DENV-E相互作用，鉴定蚊受体，研究其功能。方法与内容：⑴构建DENV-GFP报告病毒，观察其感染性、稳定性。⑵构建白纹伊蚊、中华按蚊噬菌体展示肽库，采用DENV-E为探针，从两种蚊肽中筛选抑制DENV分子或蚊的受体，在细胞水平，观察所选肽的抗病毒效应，通过Q-PCR，空斑滴定、用抗DENV-E多抗间接免疫荧光显微镜定量评价，做出所选肽分子抗DENV效应评估。⑶应用蛋白组学技术和病毒 Overlay试验，鉴定蚊组织和细胞的受体分子，分离纯化受体分子，制备成抗受体分子多抗、单抗，在细胞水平和蚊内评价抗病毒效应。⑷将制备的抗受体单链抗体片段基因、肽分子基因，连接转基因蚊载体，转入蚊内评价抗病毒效应，另通过 RNAi技术，使成蚊缺失受体功能，观察DENV侵染效应。本课题研究成功，在揭示蚊与DENV相互作用机制，发展遗传控制媒介的新策略，皆有重要理论和潜在应用价值。

（一）登革病毒E蛋白与非结构蛋白研究: 1. 成功克隆登革病毒-2E蛋白第三结构域（DIII）基因克隆，在原核表达系统表达，经免疫学鉴定具有很好免疫原性。并在真核表达系统表达，观察对DENV复制抑制效果。原核表达登革病毒-2E蛋白第三结构域（DIII）蛋白，制备成多克隆抗体，在细胞水平观察抑制登革病毒复制效果很好。2. 成功克隆革病毒-2E蛋白第I、II结构域基因克隆，在原核表达系统表达，经免疫学鉴定具有很好免疫原性，并在真核表达系统表达，观察对DENV复制抑制效果. 3. 转染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列BHK-21细胞沉默病毒复制研究, 发现登革Ⅱ型病毒prM反向重复序列具有干扰病毒复制的效果。（二 ）蚊与登革病毒相互作用-蚊受体分子鉴定及其功能研究: 1. 用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67000和30000等登革II型病毒结合分子,其功能的鉴定正在进行。C6/36细胞结合登革病毒蛋白组学二维电泳及质谱分析鉴定发现一30 kDa登革II型病毒结合蛋白分子, 质谱测序鉴定为阴离蛋白。2 .鉴定登革Ⅱ病毒连接白纹伊蚊和致倦库蚊表达蛋白分子:发现35 KDa蛋白分子分布与白纹伊蚊感染组织向性相关。35kDa 的DENV连接分子分别出现在白纹伊蚊幼虫、蛹、雌蚊，而雄蚊无这一分子，这一重要发现，提示白纹伊蚊35kDa 的DENV连接分子在登革病毒组织向性，病毒与宿主细胞相互作用方面，起重要角色。这一发现国内外尚未见报道。3．白纹伊蚊中肠、涎腺、卵巢、马氏管组织DENV连接分子筛选鉴定出35kDa结合DENV分子. 4.发现DENV-1型病毒的特异结合蛋白为25、30、40、67kD ；DENV-2型病毒的特异结合蛋白20、30、50kD ；DENV-3型病毒的特异结合蛋白27kD；DENV-4型病毒的特异结合蛋白30 kD。我们首次发现DENV1-4不同血清型病毒与白纹伊蚊和致倦库蚊连接分子差异,揭示DENV1-4组织向性差异。5. 用VOPBA法初步筛选出两个BHK-21细胞连接登革II型病毒的30及60KD的病毒结合分子，R30/60蛋白分子的进一步鉴定和功能研究正在进行。（三）开展广州市登革热疫情溯源研究,(四）白纹伊蚊RNAi通道的Argonaute和dicer基因片段克隆及蚊内各期表达量分析.