GSK3β介导的Wnt/β-catenin信号通路在利用牙本质基质构建牙髓牙本质复合体中的调控机制

Vital pulp conservative treatment is considered to be the best therapeutic method for tooth defect. Based on our previous results, as a natural scaffold biomaterial, treated dentin matrix has ideal odontogenic ability and could induce seeded cell differentiation and mineralization, and periodontal tissues formation. Thus, we hypotheses that this scaffold material may be used in dental pulp-dentin complex reconstruction in vivo. Canonical Wnt/β-catenin pathway plays an important role in cell proliferation, differentiation, and osteogenesis, etc. Glycogen synthase kinase-3β (GSK3β) is an important negative regulatory factor in canonical Wnt/β-catenin pathway. In the present study, the dental pulp stem cells are induced by treated dentin matrix in vitro. Then we analyze the expression of Wnt/β-catenin pathway in this process. Besides, we compare the odontogenic ability of different induced concentration of treated dentin matrix. Furthermore, we investigate the odontogenic effect of inflammatory microenvironment for dental pulp stem cells and the expression of Wnt/β-catenin pathway in this process. Finally, we reconstruct pulp-dentin complex in the miniature pigs and monkeys in situ.

尽可能的保留活髓是临床治疗牙齿缺损的最佳方法，我们前期研究发现牙本质基质作为一种天然的生物支架材料，具有理想的牙向诱导作用，可以诱导种子细胞形成牙周组织，据此我们推测这种支架材料有可能应用于牙髓牙本质复合体在体内的构建。经典Wnt信号通路在细胞增殖、分化和成骨等方面起重要作用，糖原合成激酶3β（GSK3β）是Wnt经典通路中重要的负性调控因子。牙髓牙本质复合体作为一个高度矿化的组织，GSK3β介导的Wnt通路也可能在其构建过程中起着重要的调节作用。本研究拟利用牙本质基质对牙髓细胞进行体外诱导，分析GSK3β介导的Wnt/β-catenin信号通路的表达情况，比较不同牙本质基质诱导浓度对牙髓细胞成牙分化能力的影响，研究炎症微环境对诱导后牙髓细胞的成牙能力的影响以及该过程中Wnt/β-catenin通路的变化情况，最终在小型猪和猴体内原位构建牙髓牙本质复合体，为牙再生组织工程领域提供新思路。

处理牙本质基质材料(TDM)是一种含有多种细胞外基质因子的较为理想的支架材料，可以诱导牙源性干细胞牙向分化。成牙过程与Wnt/β-catenin信号通路的调节有关，GSK3β是这一通路的负调控因子。本课题利用TDM诱导人牙髓间充质干细胞(hDPSCs)和慢病毒转染构建的敲低(GSK3β-RNAi hDPSCs)及过表达GSK3β的hDPSCs(Ad-GSK3β hDPSCs)，发现不同浓度的TDM浸提液对hDPSCs的成牙分化呈促进作用，GSK3β的表达降低，Wnt/β-catenin信号通路被激活。与对照组相比，GSK3β-RNAi hDPSCs的成牙能力增强，而相应的Ad-GSK3β hDPSCs的成牙能力减弱，说明TDM可以通过调控GSK3β的表达，进而调节hDPSCs的成牙分化。体内实验都同样证明了上述结论。. 为了进一步研究炎症环境下hDPSCs成牙分化的机制，本课题研究了临床上牙髓炎患者的炎症hDPSCs中TSG-6的表达，发现TSG-6及BMP/Smad 通路与炎症状态下hDPSCs的成牙/成骨能力有相关性。对TSG-6-RNAi hDPSCs及Ad-TSG-6 hDPSCs进行诱导，发现Ad-TSG-6 hDPSCs的成牙/成骨标志物和BMP-4/Smad相关蛋白水平降低，而在含50ng/mL TNF-α的矿化诱导液中，TSG-6-RNAi hDPSCs的成牙/成骨标志物和BMP-4/Smad信号通路相关蛋白水平较高。说明TNF-α通过升高TSG-6的表达，进而抑制BMP-4/Smad信号通路和hDPSCs的成牙/成骨分化能力。. 此外，利用α-半水硫酸钙(α-CSH)弥补TDM机械性能不足的缺点，将TDM和α-CSH以不同的质量比进行混合制备出了新型成骨材料TDM/α-CSH。利用红外光谱分析、X射线衍射、扫描电镜、降解实验等测量材料表征，发现这种复合材料为两种物质的物理混合，具有一定的降解特性，而且不会导致溶血；利用TDM/α-CSH的浸提液进行体外细胞实验，发现随着TDM含量增加，复合材料对细胞增殖的促进作用越强，成骨向分化能力越强；利用TDM/α-CSH修复大鼠颅骨缺损，结果显示该材料在体内表现出良好的骨诱导作用。这样的结果为我们进一步研究干细胞成牙/成骨分化的机制以及TDM的临床应用提供了新的思路和理论依据。