67kD层粘连蛋白受体作为EGCG抑制小胶质细胞活化作用的靶点确证与机制研究

抑制过度活化的小胶质细胞以减轻脑内慢性炎症反应性损伤对治疗中枢神经变性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病等具有重要意义。前期研究发现绿茶的单体成份EGCG对小胶质细胞活化具有强大的抑制效应，但其机制不明。有迹象表明，67kD层粘连蛋白受体(67LR)可能是介导EGCG抑制作用的靶点。因此，本研究拟通过多重免疫组化明确67LR在小胶质细胞上的定位；利用特异性拮抗剂和RNA干扰技术研究67LR在小胶质细胞活化中的作用；通过放射自显影结合激光共聚焦显微技术观察EGCG与67LR的空间关系，旨在研究67LR在小胶质细胞活化中的关键作用，确定EGCG抑制小胶质细胞活化作用的靶点。该研究对揭示小胶质细胞活化的分子机制、阐明EGCG的药理作用具有重要意义，为EGCG治疗慢性炎症介导的中枢神经变性疾病提供分子药理学依据。

神经变性疾病是一组病因不明、以神经元变性为特征的慢性进行性疾病的总称，为中枢神经系统多发病、常见病。神经变性疾病的发病机制尚不完全清楚，研究表明小胶质细胞活化介导的慢性炎症导致的神经元死亡在神经退行性疾病的发生、发展中起了重要的作用。我们以往研究表明，一种从绿茶提取出来的多酚类单体——表没食子儿茶素没食子酸酯〔(-)-epigallocatechin gallate，EGCG〕，具有强大的抗小胶质细胞活化效应，从而具有潜在的临床治疗神经变性疾病的应用前景，但其抗小胶质细胞活化的机制不清。.有迹象表明，小胶质细胞上67kDa的层粘连蛋白受体（67kD laminin receptor，67LR）很可能介导了EGCG抑制小胶质细胞活化的过程。本研究通过脂多糖刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞建立体外炎症模型，通过EGCG干预，从形态学和细胞分子学观察并评价绿茶多酚对细胞的形态及对67LR表达量及空间分布的影响。结果发现，原代小胶质细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7上均表达丰富的67LR，且多位于胞质内；Western blot分析发现，无论是LPS刺激抑或EGCG干预均对细胞总67LR无影响；而采用生物素化标记技术，标记膜67LR蛋白结果分析显示：静息状态下，67LR大约65%在胞内表达，而膜表面表达量不到35%；LPS刺激组大约有1/2在胞内表达，和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；EGCG（1μM、10μM 、100μM）处理组胞内67LR表达量逐渐增加，而胞外表达相应的减少，EGCG（1μM、10μM、100μM）组与LPS刺激组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。为进一步证实上述结果，我们采用激光共聚焦研究方法，结果表明，LPS刺激使67LR的空间分布集中于胞膜，EGCG处理使之分布发生了明显变化，细胞浆中67LR的分布更为弥散，胞膜上的67LR明显减少。上述研究表明，EGCG可通过促进67LR的内化影响小胶质细胞的活化，从而表明了67LR介导EGCG抑制小胶质细胞活化的作用细节。上述研究对于阐明EGCG复杂的药理学特征具有重要价值，为利用EGCG治疗神经变性疾病提供了新的药物靶点和策略。