不同来源的骨髓间充质干细胞复合牙本质基质构建生物牙根的研究

Biological tooth root by the way of tissue engineering could be a new method for tooth loss. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC) have the ability of osteogenesis and odontogenesis of periodontal tissues. Due to different origins of limbs and jaw, the biological characteristics of BMMSC from limbs and jaw are different. During the reconstruction of biological tooth root, biological behavior of different BMMSC is poorly understood. Recent researches suggest dentin matrix contain important odontogenic proteins and factors. With proper fabrication, dentin matrix can be used as a natural biological scaffold, called treated dentin matrix (TDM). TDM can induce odontogenic cells to differentiate and form tooth structure. However, if the inductive effect is also applicable to non-odontogenic cells remains to be unclear. With the induction of TDM, if the BMMSC from different origins have different biological change is also undefined. Here, we investigated the different characteristics of BMMSC from different origins and the biological changes with the induction of TDM. Besides, we also compared the biological differences between BMMSC from limbs and jaw with the induction of TDM. Finally, we reconstructed biological tooth root in situ with BMMSC and TDM in miniature pigs.

利用组织工程技术构建生物牙根有望成为一种新的治疗缺失牙的方法。骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）具有一定的成骨能力和形成牙周组织的能力。由于四肢骨和颌骨组织来源不同，因此四肢骨和颌骨的BMMSC的生物学特性也存在差异。不同来源的BMMSC在生物牙根构建中的生物学行为是否相同目前仍不清楚。我们前期研究发现牙本质基质作为一种天然的生物支架材料，可以诱导牙源性细胞分化为牙齿结构，具有理想的牙向诱导作用。这种支架材料的诱导微环境作用是否同样适用于非牙源性细胞还有待研究。在牙本质基质的诱导下，不同来源的BMMSC是否会产生不同的生物学特性的改变也值得深入研究。本研究拟在前期基础上，利用牙本质基质支架材料对BMMSC进行诱导，进而阐述这种支架材料对BMMSC的牙向诱导作用，同时比较不同来源BMMSC的生物学特性以及成牙潜能的差异，最终利用BMMSC复合牙本质基质支架材料在小型猪体内原位构建生物牙根。

处理过的牙本质基质（TDM）作为一种支架材料已被证明对牙源性干细胞具有诱导作用。但牙源性干细胞资源有限，需要寻找新的种子细胞。颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSC）为非牙源性干细胞，涉及牙齿和颌骨的发育，具有一定的成骨能力和形成牙周组织的能力，因此可以作为新的牙组织工程的种子细胞。本研究中分离培养的颌骨骨髓间充质干细胞具有典型的间充质细胞特性，具有成脂、成骨、成血管以及成神经等多向分化的潜能。在TDM的诱导下，JBMMSC的细胞活性明显增强；通过Real-time PCR发现其成牙和成骨相关的基因如DMP-1、ALP、Periostin、OPN、DSPP, Decorin和OCN等均可以表达上调；通过Western Blotting发现其成牙和成骨相关蛋白如DMP-1、Periostin、CAP、OPN和OCN等也相应的表达增强，这样的结果与基因检测结果相一致。体内实验结果发现可以生成含有血管成分的纤维结缔组织样结构，通过免疫组化证实这些新生的组织可以表达成牙相关的特异性蛋白如DSPP、DMP-1、OCN、OPN、Decorin、TGF-β、COL-I、COL-III、Periostin、Fibronectin和ALP。我们的研究成果证明JBMMSC在被TDM诱导后成牙成骨的分化程度均有提高，这说明非牙源性干细胞仍是牙根组织工程中的有前景的种子细胞。. 大动物实验是我们进行组织工程研究的必经之路，但是将TDM和BMMSC的复合物植入体内出现了较多的排斥和感染情况。为了充分探究大动物实验的过程，我们使用小型猪牙囊细胞作为种子细胞进行生物牙根的原位构建。结果显示小型猪牙囊细胞为间充质来源的具有多向分化潜能的干细胞。在我们前期研究的基础上，我们对小型猪牙本质基质材料的处理方法进行了改进，得到了符合实验要求的支架材料pTDM。在pTDM的诱导下，牙囊细胞的生物活性明显增强，然后我们将小型猪的牙囊细胞复合小型猪牙本质基质进行牙槽骨内原位移植构建生物牙根，结果显示在pTDM支架材料内侧（牙髓牙本质侧），可以看到牙髓牙本质复合体样结构，包括前期牙本质，成牙本质细胞突和血管样组织；而在pTDM支架材料外侧（牙周组织侧），可以看到牙骨质样结构和牙周韧带样结构的形成。这样的结果为我们下一步生物牙根的组织构建策略提供了新的思路。