转录因子Tac1p在近平滑念珠菌唑类药物耐药中的分子调控机制研究

The emergence of Candida parapsilosis isolates resistant to azoles has proposed great challenges to clinical treatment of candidiasis. However, the study of azole resistance mechanism in Candida parapsilosis is very limited. Upregulation of multidrug transporters like CDR is the principal mediators of resistance to azoles. The zinc cluster transcription factor Tac1p has been shown to control CDR expression in Candida albicans, while there’s no description in C. parapsilosis. We have obtained the first isolate of C. parapsilosis globally with TAC1 gene mutation induced by in vitro, which was accompanied with the CDR1 overexpression and resistance to azoles. Based on bioinformatics analysis and the high correlation between TAC1 mutation and azole resistance, it’s proposed that Tac1p is an important transcription factor of CDR, and the mutated alleles in C. parapsilosis could resulted in activation of CDR1 promoter and multidrug resistance. A plasmid-based CRISPR/Cas9 system will be used for TAC1 gene editing in the present study. The phenotypes of isolates with and without TAC1 gene editing will be compared to investigate the regulatory role of TAC1 in C. parapsilosis. In addition, to show the important role of TAC1 gene from clinical epidemiology aspect, the TAC1 gene sequences will be analyzed among clinical isolates resistant to azoles. This study will provide theoretical information for rapid screening and treatment of azole resistant isolates.

近平滑念珠菌唑类药物耐药株的出现给临床治疗带来严峻挑战，而其耐药机制研究匮乏。药物外排泵基因CDR高表达是导致唑类耐药的重要机制，白念珠菌中发现转录因子Tac1p在CDR调控和唑类耐药中起重要作用，但近平滑念珠菌中TAC1调控通路尚不明确。我们获得了首株经体外诱导产生了TAC1基因突变的近平滑念珠菌，并且伴有外排泵基因CDR1的高表达和唑类耐药的产生。基于突变位点与耐药的高度相关性，本研究提出科学假设：Tac1p是近平滑念珠菌唑类耐药的重要调控因子，其突变可使转录因子处于高活性状态，通过上调CDR基因表达引起菌株耐药性改变。研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TAC1基因缺陷和定点突变菌株，比较基因敲除及突变前后菌株表型变化来探索其耐药调节作用；另外从流行病学角度分析TAC1突变在临床唑类耐药株中的分布情况。本研究将为近平滑念珠菌耐药快速筛查和临床耐药株治疗提供重要理论依据。

近平滑念珠菌感染是医院血流感染的主要原因，更令人担忧的是，此外，耐唑性近平滑念珠菌菌株已造成全球多家医院克隆性暴发，给临床治疗带来严峻挑战。然而，对近平滑念珠菌唑类药物耐药和毒性的机制认识尚缺乏。在本研究中，我们通过体外氟康唑进化方法获得了一组对氟康唑耐药性增强的等基因型近平滑念珠菌菌株。整合分析表型进化趋势和转录组/全基因组，挖掘潜在调控机制，并利用CRISPR基因编辑技术进行功能验证。研究表明，连续使用氟康唑较容易导致耐药的快速发生，甚至产生对唑类药物的交叉耐药。菌株在仅经2次诱导传代后开始出现对氟康唑的敏感性下降，第15代即出现对氟康唑耐药现象，第19代出现对氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的交叉耐药性。表型分析显示，与亲本F0相比，氟康唑进化株F50的毒力减弱，包括生物膜形成、耐胁迫能力和体内毒力。与F0相比，F50中有153个基因表达差异。参与膜组分、发病机制的基因表达下调，而转录因子、辅助因子和裂解酶活性上调。其中ABC转运蛋白CDR1及其转录激活因子TAC1表达上调最显著，全基因组测序发现F50在TAC1中携带唯一有义突变（编码G490R）。将该突变体碱基引入F0后，在牺牲生物膜形成能力和体内毒力的情况下，菌株获得了对唑类药物的抗性，且TAC1和CDR1在F0_Tac1G490A菌株中中的表达量均显著高于F0。纠正F50突变后，TAC1和CDR1的表达水平下降，对唑类药物的敏感性恢复，毒力增加至接近F0水平。CHIFNET项目显示，通过体外诱导获得的突变G490R真实存在于一株临床分离株中，该临床分离株中G490R突变体的功能也被证实与F50中的功能一致。此外，测序结果显示有19株氟康唑耐药的近平滑临床分离株的TAC1携带共10种有义突变，其中4种突变被证实直接导致氟康唑耐药，分别为L263S、S772L、L518F和T492M。该项目是第一个直接证据表明近平滑念珠菌TAC1的功能获得突变均有多重功能——引起对唑类药物的交叉抗性和毒力减弱。本研究为探究近平滑念珠菌的发病机制和耐药过程提供了理论依据，临床医师在用药时应连续监测菌株的药物敏感性，警惕因诱导产生的获得性耐药导致治疗的失败以及无药可用状况。