近平滑念珠菌唑类药物体内获得/体外诱导耐药机制多组学研究

Candida parapsilosis has become the most important Candida species causing candidemia, and the isolates resistant to azole drugs have emerged. Because there is limited antifungal drug for treatment of C. parapsilosis, the outcome for patients infected with resistant isolates are usually poor. However, there is little research on the mechanism of azole resistance in C. parapsilosis. In the present study, we will collect the acquired resistant isolates in vivo from the fungal surveillance programs in China, and analyzed the process of the resistance emergence by review of clinical histories. In addition, we will also induce the wide isolates to become resistance to three azoles in vitro, as well as analyzing the characteristics of each azole drug and the interactions between these drugs. The conclusion by analysis will help the doctors give more proper antifungal treatment to patients. After that, we will do research on resistance mechanisms on the matched susceptible and resistant isolates by genomics, transcriptomics, and proteomics studies. Then, we will confirm the changes in resistant isolates from aspect of DNA, RNA and proteins after bioinformatics analysis. By describing the molecular resistance mechanisms of C. parapsilosis to azole drugs, we will provide important references for the designation of new antifungal drugs, as well as the reformation of previous drugs, which is of great clinical and scientific values.

近平滑念珠菌成为国内引起念珠菌血症第一位的菌株，已经出现对唑类药物耐药菌株，基本无其他药物代替，因此唑类耐药近平滑念珠菌感染导致临床后果严重，而目前国内外对其耐药机制的研究基本空白。本研究将通过回顾性收集并研究体内获得性耐药菌株（我们拥有丰富的临床真菌感染菌株库进行筛选），并前瞻性研究体外三种唑类药物诱导耐药过程，探索不同唑类药物耐药产生的区别和相互关系，包括每种药物耐药产生的时间、是否会对其他唑类药物产生影响等，得到的结论将帮助临床更好的选择抗真菌药物、制定合理疗程和剂量，预防耐药的产生。对前部分研究筛选出的遗传背景一致的体内获得和体外诱导菌株通过多组学研究进行耐药机制筛查，并对筛查出的基因、转录及蛋白水平的差异进行验证，阐明近平滑念珠菌对唑类药物耐药以及药物间交叉耐药的主要分子机制，为快速筛查耐药机制筛选靶点、新药的研发和传统药物的改造创新提供理论依据。这将具有重大的临床意义和科学意义

近平滑念珠菌是国内引起念珠菌血症的主要病原菌，近年来近平滑念珠菌唑类药物耐药率逐渐升高，增加了临床念珠菌感染的治疗难度。因此，本研究筛选出患者体内唑类药物诱导耐药病例进行耐药产生过程分析，发现长期使用低剂量氟康唑治疗念珠菌感染可诱导耐药菌株出现。体外使用氟康唑、伏立康唑和泊沙康唑对临床菌株PU106进行体外诱导耐药，使用氟康唑诱导菌株，第8代产生氟康唑中介，第12代产生耐药，同时菌株对伏立康唑和泊沙康唑交叉耐药现象明显；而使用伏立康唑和泊沙康唑诱导耐药的菌株诱导至第40代未出现耐药菌株。通过体外诱导耐药试验发现与体内相似，长期使用氟康唑可诱导唑类药物耐药菌株的出现，而长期使用伏立康唑或泊沙康唑并未发现诱导耐药现象，这对于指导临床使用唑类药物进行抗真菌治疗具有重要意义，特别应注意长期低剂量使用氟康唑治疗后引起菌株耐药以及唑类药物之间交叉耐药而导致治疗失败。对遗传背景一致的体内敏感/耐药菌株进行基因组、转录组学测序学分析，基因组测序发现耐药菌中发现9个特异性SNP位点；转录分析发现耐药菌株的几个药物外排泵相关基因的表达上调，根据生信分析结果，差异表达基因与类固醇合成、鞘脂类代谢及多种氨基酸代谢相关。针对9个SNP位点所在基因进行表达量分析，筛选出转录因子MRR1表达量显著上调，提示该SNP位点突变与唑类药物耐药明显相关。本研究进一步将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于基因功能验证，分别采用外源导入和内源表达Cas9酶和sgRNA的方法，建立近平滑念珠菌基因功能研究的细胞模型，成功构建MRR1敲除菌株，药敏试验表型结果显示敲除菌株对唑类药物的敏感性升高。将进一步在本研究的基础上，下一步将在近平滑念珠菌的耐药机制领域展开更深层次和更广层面的研究，为指导临床抗真菌治疗和新药物研发提供更多的数据支撑。