GHR基因天然反义链转录本（GHR-AS）对鸡肌肉生长发育调控研究

GHR gene plays important roles in animal growth and development.The dwarf chicken is due to the mutations of GHR Gene. Hitherto ten kinds of sense strand transcripts from GHR gene(GHR-S) have been found in chicken. In our former study, the natural antisense strand transcript of the gene (GHR-AS)was first found in liver with DGE sequencing technology. GHR-AS was expressed in chicken muscle and liver and its sequence was obtained using antisense strand specific PCR and sequencing technology. The sequence of GHR-AS without ORF(open reading frame) indicated that it was a long noncoding RNA (lncRNA). Recent studies showed that natural antisense transcripts functioned in cell proliferation and differentiation, and tissue development. In this project, the interactions between GHR-AS and GHR-S will be investigated during muscle development in Qinyuanma chicken. This study will be beneficial in understanding GHR function and will be helpful in realizing muscle modulation. Furthermore, the implementation of this project will provide important information for molecular breeding in chicken.

生长激素受体基因（GHR）对动物生长发育具有重要作用，该基因突变能够导致矮小鸡的发生。目前发现鸡GHR基因10种转录本均为DNA正义链转录本（GHR-S），本课题组前期发现在鸡肝脏组织中存在GHR天然反义链转录本（GHR-AS），并通过反义链特异PCR和测序等方法证实GHR-AS在鸡肌肉和肝脏组织中表达，且为一长链非编码RNA（lncRNA）。最新研究表明功能基因反义链转录本多为lncRNA，且与基因正义链转录本共同作用参与调控细胞增殖分化和组织发育，对生物生长发育具有重要作用，推测GHR-AS可能通过GHR-S参与鸡生长发育调控。为了深入研究GHR-AS对鸡生长发育的调控作用，本项目拟以清远麻鸡为研究对象，分析GHR-AS与GHR-S之间可能存在的调控关系，阐明GHR-AS对肌肉发育的作用机制。研究结果将为全面了解GHR基因功能、骨骼肌发生发育的特异性调控及确立分子育种新靶点提供依据。

矮小鸡GHR mRNA的表达量显著高于普通鸡，表明GHR在基因表达过程中受到精密的调控。本研究通过RACE技术克隆了鸡GHR-AS全长，并分析了其时空表达特征，在LMH细胞和成肌细胞中对其功能进行了研究，得到如下结果：.(1) GHR-AS是由RNA Polymerase Π转录并具有典型的Ploy（A）结构的分子。其利用GHR基因内含子6作为转录本的3′末端从而形成的新可变剪接体，与现有已知的GHR转录本方向相反，且在GHR基因外显子6，7，8和3′UTR 位置处与GHR-S序列反向互补。.(2) 组织表达谱分析表明，GHR-AS在11周龄鸡肺、垂体、肝脏和下丘脑等组织高表达，而在卵巢、肾和腿肌低表达。时序表达分析表明GHR-AS在肝脏组织中随鸡的发育而升高，但是在肌肉组织中，出壳前的表达量显著高于出壳后的表达量。.(3) 在LMH细胞中干扰GHR-AS，GHR-S表达量显著降低，CHIP-qPCR分析表明GHR-S-V1启动子H3K9me2的水平升高，而第9位赖氨酸甲基化是基因转录活性降低的标志，这可能是GHR-AS调控GHR-S的机制之一。此外，干扰组细胞增殖变慢，细胞周期阻滞在G1期，表明GHR-AS影响GHR-S的转录水平和细胞增殖。在肝脏组织和LMH细胞中，RNaseA实验分析表明GHR-AS与GHR-S在GHR基因外显子9处形成双链，可能对GHR-S起到保护作用，同时也是GHR-AS调控GHR-S的作用位点。.(4) 在鸡成肌细胞中，cGH可以诱导细胞表达IGF1，血清饥饿条件下诱导水平显著高于有血清培养条件。干扰GHR-AS后，用500ng/mL cGH诱导的IGF1显著低于对照组，同时成肌细胞增殖有变慢趋势，细胞周期阻滞在G1期，但是与对照组差异不显著。在肌肉组织和成肌细胞中，RNaseA实验分析表明GHR-AS与GHR-S在GHR基因外显子9处形成双链，可能对GHR-S起到保护作用，同时也是GHR-AS调控GHR-S的作用位点。 .总之，GHR-AS对GHR-S具有保护作用，其机制主要是两者可以通过GHR-exon9形成双链RNA，并可能招募染色质甲基化修饰酶，改变GHR-S启动子区组蛋白甲基化程度，从而调控GHR-S的表达。在成肌细胞中，GHR-AS可以作用于GH-GHR-IGF1通路，但是对成肌细胞增殖影响不明显，是否影响成肌细胞的