UTMD介导shRNA转染MSCs移植治疗心肌梗死的实验研究

Heart failure after acute myocardial infarction (AMI) is an important cause of death. To prevent or even reverse adverse cardiac remodeling and eventually heart failure is a major goal of current cardiac research field. Many animal and preclinical studies have shown that autologous mesenchymal stem cell (MSCs) transplantation into infracted hearts to treat AMI is very promising. However, some studies showed little effect of MSCs on AMI. The main reasons for the low efficacy in these studies could be: injected MSCs do not effectively home to the ischemic region and homed MSCs cannot survival well to limit their functions. To circumvent these problems, this study aims to explore the potential use of ultrasound targeted microbubble destruction(UTMD)technique to achieve the following two goals: ①Use UTMD to mediate non-viral transfection of MSCs with prolyl hydroxylase domain(PHD2) shRNA plasmids, so that transfected MSCs can survival better in the hypoxic environment to exert their functions; ②Use UTMD to increase the permeability of capillaries, so that the homing of MSCs injected through the tail vein to the ischemic cardiac region can be enhanced. Eventually, these manipulations should decrease myocyte death, increase angiongenesis and new myocardium formation and hence improve cardiac function. This study will shed lights on effective and noninvasive stem cell transplantation methods into infracted hearts and provide the experimental basis for such treatment.

急性心肌梗死（AMI）后诱发的慢性心衰是心血管系统疾患的主要死亡原因。寻找一种能阻止或逆转AMI诱发心衰心肌重构过程的方法是目前研究的焦点。大量动物及前期临床实验结果显示，自体移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗AMI是一很有希望的疗法。但文献报道其疗效不显著，其中很重要的原因是干细胞靶向归巢能力低；及归巢至缺血心肌后存活率低，未能发挥其有效功能。本课题拟采用超声靶向破坏微泡(UTMD)来克服以上干细胞治疗的局限性：① 在体外将脯氨酰羟化酶域-2(PHD2) shRNA转染至MSCs，增强后者在缺氧环境下的存活能力；②在经静脉输注混合了超声微泡的PHD2-MSCs的同时，以超声辐照缺血心肌，通过UTMD产生的声孔效应将具备较强存活能力的MSCs靶向释放于局部，以促进无创性静脉移植的MSCs向缺血心肌靶向归巢，最终达到减少心肌死亡、促进新血管和新心肌的形成，从而改善心脏功能，提高患者存活率。

背景 急性心肌梗死（ AMI）后诱发的慢性心衰是心血管系统疾患的主要死亡原因。寻找一种能阻止或逆转 AMI 诱发心衰心肌重构过程的方法是目前研究的焦点。大量动物及前期临床实验结果显示，自体移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗 AMI 是一很有希望的疗法。但文献报道其疗效不显著，其中很重要的原因是干细胞靶向归巢能力低；及归巢至缺血心肌后存活率低，未能发挥其有效功能。本课题拟采用超声靶向破坏微泡(UTMD)来克服以上干细胞治疗的局限性，在经静脉输注混合了超声微泡的 PHD2-MSCs 的同时，以超声辐照缺血心肌，通过 UTMD 产生的声孔效应将具备较强存活能力的 MSCs 靶向释放于局部，以促进无创性静脉移植的 MSCs 向缺血心肌靶向归巢，最终达到减少心肌死亡、促进新血管和新心肌的形成，从而改善心脏功能。.目的 ①探讨UTMD介导绿色荧光蛋白(EGFP) 基因转染的增强作用；② 体外研究：采用UTMD联合RNA干扰技术，探讨PHD2-shRNA转染骨髓干细胞（MSCs）的可行性；③ 体内研究：UTMD介导PHD2修饰的MSCs移植治疗大鼠急性心肌梗塞(MI)的治疗效果。 .方法 ①通过薄膜水化法制备阳离子脂质微泡，评测阳离子脂质微泡浓度、平均粒径及表面电荷，并观察其与质粒结合能力及心脏造影显像效果。②体外研究：构建靶向质粒(shPHD2)和对照质粒(EGFP)；首先将MSCs分为Plasmid、Plasmid + Ultrasound及Plasmid + UTMD组，研究UTMD介导质粒转染MSCs增强作用，进而对UTMD介导质粒转染MSCs进行参数优化；为证明shPHD2-EGFP诱导血管新生因子表达，实验分为Control组、 EGFP组及 shPHD2-EGFP组，检测PHD2、HIF-1α及血管新生因子等基因表达；为证明shPHD2-EGFP在OGD下对细胞保护作用，实验分为Control、BMSC、BMSC-EGFP及BMSC-shPHD2-EGFP组，通过UTMD介导shPHD2转染MSCs细胞，检测细胞凋亡。③ 体内研究：建立大鼠急性MI动物模型，首先30只大鼠随机分为MI、MI-MSCEGFP、及MI-MSCshPHD2-EGFP组，术后3天检测MSCs移植效果；另120大鼠随机分为：Control、PBS、MI-BMSCsEGFP及MI-BMSCs