p65/Sp1-Dnmt1介导甲基化调控糖尿病肾病足细胞nephrin和podocin表达的研究

Methyltransferase (Dnmts) was involved in tumorigenesis and cell aging, however, its biological role in podocytes is unclear.Our preliminary results found that: ① the protein expression of Dnmt1 was increased in podocyte of DN patients; ② high glucose increased the protein expression of Dnmt1 in vitro; ③ Dnmt1 silencing reduced overall genomic methylation level and increased the protein expression of nephrin and podocin. These results indicated that Dnmt1 mediated methylation may be involved in podocyte injury of DN, however, the regulation mechanism of Dnmt1 mediated podocyte injury need to be further elucidated. We recently observed that inhibition expression and activity of Sp1 and p65 decreased HG induced Dnmt1 protein expression. Therefore, we proposed that p65/Sp1 might mediate Dnmt1 expression and involved in podocyte injury pf DN. Dnmt1 transfection and interference in vitro and podocyte Dnmt1 conditional knockout and knockin diabetic mice were used for exploring its impact on the expression of nephrin and podocin; direct target relationship between p65/Sp1 and Dnmt1 was identified by IP and ChIP technology. This study is expected to reveal a new mechanism of podocyte injury and repair in DN, and provide new targets and scientific basis for prevention.

甲基转移酶(Dnmts)参与肿瘤发生及细胞衰老，但其在足细胞中的生物学作用不清楚。我们前期研究发现：①DN患者肾小球足细胞Dnmt1高表达；②高糖上调体外足细胞Dnmt1表达；③沉默Dnmt1降低基因组整体甲基化水平，并上调nephrin和podocin蛋白表达。提示Dnmt1介导的甲基化可能参与DN足细胞损伤，但Dnmt1的调控机制尚不清楚。我们新近发现：抑制核转录因子Sp1、p65可降低高糖诱导的Dnmt1高表达。由此推测：p65/Sp1可能介导Dnmt1高表达，导致DN足细胞nephrin和podocin低表达引起足细胞损伤。本研究拟通过体外转染和干扰Dnmt1及足细胞条件性Dnmt1基因敲除和敲入糖尿病小鼠，探索其对nephrin和podocin表达影响；通过IP、ChIP技术，获得p65/Sp1直接调控Dnmt1的证据。项目有望揭示DN足细胞损伤修复的新机制，为其防治提供新靶点。

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，是2型糖尿病患者的重要死亡原因, 也是导致终末期肾功能衰竭的主要病因。既往大量研究表明足细胞在蛋白尿相关性肾脏疾病的发生发展中发挥关键作用，是研究糖尿病蛋白尿发生与进展的中心靶细胞，因此，阐明DN足细胞损伤的分子机制具有重要意义。甲基转移酶(Dnmts)及甲基化参与肿瘤发生及细胞衰老，但其在足细胞中的生物学作用不清楚。.项目以2型DN肾小球足细胞为研究对象，首次通过体内外实验明确DNA甲基化在2型DN足细胞损伤中的作用及可能分子机制。研究发现：(1) DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷（5-Azacytidine）明显减少白蛋白尿，降低血肌酐，并抑制系膜基质增生及基底膜增厚，减轻足突融合, 增加足细胞数目及足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、podocin 表达，然而代谢指标如体重，饮食、饮水和空腹血糖未发生明显改变。(2) 在体外高糖处理的分化成熟足细胞，DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine) 上调足细胞裂孔膜蛋白nephrin、podocin蛋白表达，抑制足细胞活动性，降低足细胞白蛋白流量率，改善足细胞滤过屏障功能。(3) DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷或5-氮杂-2'-脱氧胞苷能降低2型DN肾小球足细胞裂孔膜基因NPSH1和NPSH2启动区高甲基化。(4)自发性2型糖尿病db/db小鼠肾小球足细胞及体外高糖处理的足细胞Dnmt1、Sp1及NF-κB p65表达增加。2型DN患者肾小球足细胞Dnmt1表达明显增加。DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷、Sp1抑制剂MithramycinA及NF-κB p65抑制剂BAY 11-7082可抑制高糖导致足细胞Dnmt1高表达。(5) 免疫共沉淀显示Sp1及NF-κB p65在核内结合。染色质免疫共沉淀及荧光素酶报告基因显示Sp1结合到Dnmt1启动子区域（-119~+102bp）并直接调控Dnmt1转录活性。这些结果表明Dnmt1抑制剂也许是治疗DN的新路径，Sp1/NFκB p65-Dnmt1 信号通路也许是DN足细胞保护的治疗新靶点。项目研究结果有助于加深对2型DN肾小球足细胞损伤机制的理解，为发展新的治疗策略提供重要的线索。