PVT1调控线粒体功能介导糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制

The onset and development of diabetic nephropathy is primarily caused by the lesion of podocyte，which is triggered by the damage of mitochondrial fuction.Earlier reports have demonstrated that PVT1 is closely associated with diabetic nephropathy.In this study, we found that PVT1 was expressed in mouse podocytes by fluorescence in situ hybridization(FISH).High glucose could stimulate the expression of PVT1,leading to the mitochondrial dysfunction and podocyte damage, whereas gene knockdown of PVT1 showed a reversal effect on high glucose-induced podocyte lesion and mitochondrial dysfunction. Rac1 signaling pathway activation plays a pivotal role in diabetic podocyte injury and mitochondrial disorder. Our findings provided evidence that PVT1 could take part in the podocyte lesion and mitochondrial dysfunction by triggering Rac1 mRNA directly or competitively binding to miR-182 to regulate Rac1 mRNA indirectly as ceRNA. To verify the hypothesis,we cultured conditionally immortalized mouse podocyte and created PVT1 knockout mouse model by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering, investigating the potential role of PVT1 and Rac1 signaling pathway in podocyte damage and proteinuria demonstrating the interactions between PVT1,miR-182 and Rac1 in diabetic nephropathy.What’s more, targeting this cascade might be a potential renoprotective and therapeutic strategy for diabetic nephropathy.

足细胞损伤是糖尿病肾病(DN)发生的始动因素，而线粒体功能障碍是触发足细胞损伤的早期事件。近年来研究证实，PVT1与DN密切相关，我们应用荧光原位杂交检测证实PVT1在小鼠足细胞表达，且高糖刺激可显著上调足细胞PVT1表达，导致足细胞损伤及线粒体功能障碍，而PVT1基因沉默则可明显改善足细胞粒体功能障碍，逆转足细胞损伤。Rac1信号通路在DN足细胞损伤及线粒体功能障碍中起举足轻重的作用，我们前期研究提示，PVT1可直接靶向Rac1mRNA，也能作为ceRNA竞争性结合miR-182而调控Rac1，参与足细胞损伤以及线粒体功能异常。本研究以DN关键因素—足细胞线粒体功能障碍为靶点，以小鼠足细胞系及靶向PVT1的CRISPR/Cas9基因敲除小鼠为研究对象，深入探讨PVT1与miR-182、Rac1在足细胞损伤中的靶向调控关系，这将为DN发病机制提供新的视点，为DN治疗提供新靶点。

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾脏病的主要因素。足细胞是位于肾小球基底膜外侧的一种高度分化的脏层上皮细胞，对蛋白质的滤过及肾小球基底膜成分的更新起重要作用。足细胞损伤是DN蛋白尿发生的始动因素，而蛋白尿是DN进展的独立危险因素。研究发现，野生型DN大鼠足细胞存在线粒体过度分裂现象，线粒体功能障碍是DN的关键环节，是足细胞损伤的早期事件，线粒体功能障碍可能是足细胞损伤的干预靶点。 .本项目中，我们发现与正常对照组相比，长链非编码RNA PVT1在DN病人血浆中的表达明显升高，且其表达量与病人血肌酐和尿蛋白水平呈现正相关；应用荧光原位杂交检测证实PVT1在人足细胞和小鼠足细胞中表达，且高糖刺激可显著上调足细胞PVT1表达。通过应用RNA pull-down实验，我们发现PVT1与m6A去甲基化蛋白ALKBH5相互作用；进一步研究显示高糖环境下，ALKBH5表达升高，导致PVT1发生去甲基化从而增强其稳定性。通过构建DN小鼠模型，我们发现病理状态下，足细胞损伤、线粒体功能障碍以及炎症反应同时存在，而足细胞特异性PVT1敲除小鼠的构建（Nphs2-Cre/Pvt1 flox/flox）则可明显改善DN状态下线粒体功能障碍和炎症反应，从而逆转足细胞损伤的发生。机制研究显示，高糖条件下PVT1与下游蛋白Trim56相互作用，后者可与ampkα蛋白结合并增强ampkα的泛素化修饰，继而提高线粒体分裂蛋白drp1的磷酸化水平，致使线粒体分裂增加，结构和功能发生改变；损伤的线粒体释放mtDNA进入细胞浆，激活cGAS-STING信号通路释放大量细胞因子（IL-6,TNFα及ccl-10），最终引发炎症反应，导致足细胞损伤。同时我们发现，Trim56亦可通过直接影响STING蛋白的泛素化修饰，调控高糖下足细胞炎症反应的发生。.本研究以DN关键因素—足细胞线粒体功能障碍为靶点，以人足细胞系及靶向PVT1的基因敲除小鼠为研究对象，深入探讨PVT1与Trim56在足细胞线粒体损伤和炎症反应中的靶向调控关系，这将为DN发病机制提供新的视点，为DN治疗提供新靶点。