邻苯二甲酸二丁酯（DBP）降解菌的筛选及其生物降解途径研究

Di-n-butyl phthalate (DBP) as an important compound of phthalic acid esters (PAEs) has a higher biological toxicity and is widely used in the plastic and pesticide manufacturing industries. The continuous use of agricultural films and insecticide can involve risks and hazards to humans, animals and the environment. Although the problems of DBP residues in agricultural land have become an issue of major concern in current studies, DBP-degrading bacteria resources evolve slowly due to the uneven distribution of the contaminant and lower mass transfer efficiency in polluted farm soil. And the researches to explicate proper understanding of DBP degradation mechanisms are still rare. This project therefore aims to screen and identify degrading strains by enrichment culture and illuminate the degradation characteristics, DBP biological degradation kinetics and dynamic changes assessment of degrading strains. Incorporated with transcriptomics, Quantitative Real-time PCR, heterologous expression of hypothetic genes and enzymatic properties, the correlation among the DBP metabolic network, biodegradation pathway and regulation mechanism will be detected. This research would provide the theoretical evidence to determine the DBP biodegradation pathway, molecular mechanisms, and promote a new perspective on ecological remediation of DBP contamination in agriculture.

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种重要的酞酸酯（PAEs）类化合物，具有很高的生物毒性，是塑料棚膜和农药的重要成分，目前农业用地中 DBP 残留问题已成为全球普遍关注的热点问题。然而由于受污染物农业用地中 DBP 分布不均及传质效率低等局限，土壤中高效 DBP 降解菌进化缓慢，有关 DBP 的降解机理及功能基因的研究鲜有报道。为全面认识功能菌对 DBP 降解调控机制，提高修复效率，本项目拟通过培养驯化富集的方式，获得一株 DBP 高效降解菌并系统研究其降解特性，进而全面获取 DBP 的生物学降解动力学特性及降解菌体微观动态变化；通过转录组学、荧光定量 PCR 技术、异源表达技术及相关蛋白的酶学特性研究，系统剖析 DBP 的生物降解途径，系统揭示功能基因对 DBP 代谢的调控机理。研究成果为解决 DBP 生物代谢调控机制研究提供理论基础，有望为农业 DBP 污染生物修复的研究打开新思路。

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种重要的酞酸酯（PAEs）类化合物，有很高的生物毒性，是塑料棚膜和农药的重要成分。目前农业用地中 DBP 残留已成为研究的热点问题。为全面认识功能菌对 DBP 降解机制，本项目拟通过系统研究 DBP 降解过程降解菌体理化性质、微观动态以及降解能力，探讨了解 DBP 降解菌的基本性质及对 DBP 的降解特性，并通过转录组学及荧光定量 PCR 技术，推测 DBP 的生物降解相关代谢途径，进而通过代谢相关基因的异源表达及相关蛋白的酶学特性研究，以期探明 DBP 的生物降解途径及调控机理，结论如下：.①筛选获得一株以 DBP 为唯一碳源和能源的高效降解菌株，经鉴定将该菌株命名为 Pseudomonas sp. DNB-S1。菌株 DNB-S1 的最适生长条件是：DBP 浓度 500 mg/L，温度35℃，pH 为 7.0，接菌量为3 %，摇床转速设置为125 r/min。最适生长条件下，48 h 内 DNB-S1 对 DBP 去除率可达到 90 % 以上。一阶模型能够很好的描述 DNB-S1 降解 DBP 的动力学规律。DNB-S1 会减少细胞表面的肽聚糖含量来增加其捕捉DBP 的能力。②利用 RNA-Seq 技术对降解菌株转录结构进行优化，比较分析降解菌株在不同 DBP 浓度处理条件下降解菌株转录本的变化，并推断 DBP 的代谢可能通过多条途径进行代谢，包括龙胆酸代谢路径。在低浓度碳饥饿时，酯酶的表达量最高，随着 DBP 浓度的升高龙胆酸 1,2-双加氧酶表达量升高。③3,4-二羟基苯甲酸脱羧酶基因转入感受态细胞中，通过同源序列比对，该酶与 Enterobacter sp. HK169 菌株中的CP017087.1编码蛋白的氨基酸序列相似度达到了100 %，且该酶不是膜蛋白，不含有信号肽序列，定位于细胞质，同时 DBP 及其代谢产物会诱导 3,4-二羟基苯甲酸脱羧酶的高效表达。④ 3,4-二羟基苯甲酸脱羧酶在 30 ℃至35℃之间、pH 处于 7.0 至 8.0 的范围内活性较高，该降解酶具有较强的抗逆性，在高浓度的 DBP 环境中仍然能够保持活性。Cd2+ 对降解酶活性表现出抑制的作用；而 Ca2+、Mg2+ 和 Fe2+ 这三种离子能够激活降解酶。