褐藻多糖酶解产物抑制alpha-葡萄糖苷酶活性机理及构效关系研究

褐藻多糖是一种来源于褐藻细胞壁的水溶性酸性多糖，主要从海带、巨藻、马尾藻等褐藻中提取得到，目前，已广泛应用于医药、食品、化工等领域。通过各种降解方法制备的褐藻寡糖，在抗肿瘤、促进生长等生物活性研究方面近年取得了显著进展。在申请人的前期工作中发现不同组成的褐藻多糖酶解产物具有不同的alpha-葡萄糖苷酶抑制活性，其中部分组分抑制活性很强，显示了将其开发成为辅助降糖保健食品的可能性，而该方面的活性以及降解产物的抑制活性机理国内外尚未见报道，因此，本课题着重对具有不同组成和分子量的褐藻多糖酶解产物进行分离纯化，在得到具有不同组成的单体后，从分子量大小、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的组成与比例、聚合度、是否含有不饱和键等角度分析单体与酶活性部位结合能力的变化，从而得出上述活性抑制机理及构效关系规律，为定向酶解褐藻多糖、建立高效褐藻寡糖生产技术体系以及开发高活性褐藻寡糖保健食品提供理论依据。

褐藻多糖（褐藻胶）是一种来源于褐藻细胞壁的水溶性酸性多糖，由-D-甘露糖醛酸 (M) 和-L-古洛糖醛酸 (G) 通过1→4糖苷键相连接的线性水溶性酸性多糖，主要是由三种片段所组成，分别为：GG片段、MM片段、GM片段。.本课题重点筛选了高效降解褐藻多糖的微生物，对微生物的特性进行了研究，通过定向诱导培养的方式获得了降解褐藻多糖的裂解酶，对前期获得的紫红链霉菌Streptomyces violaceoruber的产褐藻多糖裂解酶的特性进行了详细研究。得到了电泳纯的酶，计算得到褐藻胶裂解酶分子量约为27.2 kDa，该酶属于低分子量褐藻胶裂解酶。该褐藻胶裂解酶的最适 pH值为6.0，在 pH 5.5-9.5 范围内稳定；该酶在最适pH 6.0 下的最适温度为70℃，该褐藻胶裂解酶在 55℃，保温 30 min 酶活损失低于15%。对褐藻胶裂解酶活力有促进作用的金属离子和化合物包括：Mn2+ 、Fe2+ 、Mg2+；对褐藻胶裂解酶活力有抑制作用的金属离子和化合物包括：Cu2+、Zn2+、Ca2+、EDTA、SDS和β-巯基乙醇。褐藻胶裂解酶对MM具有显著降解作用，产生DP 2-7的褐藻胶寡糖。.利用酸解和酶解的方法对褐藻多糖进行了降解处理，获得了纯MM和GG片段。确定了原料褐藻胶的M/G=0.61,总糖含量为73.0%，糖醛酸含量约65.7%；运用液相-质谱联(LC-MS) 测得：甘露糖醛酸片段(MM)的聚合度在1到10之间，古洛糖醛酸片段(GG)的聚合度在1到4范围内。酸降解制备的褐藻寡糖通过荧光辅助糖电泳法检测，在分离胶浓度为35%，浓缩胶浓度为4%时,以及运用薄板层析技术(TLC)，当展开剂为正丁醇-甲酸-水(4:6:1,v/v/v)，展开两次时，可以使得寡糖组分有效分离。MM有明显的抑制-葡萄糖苷酶活性的效果，但是GG的抑制效果不明显。MM在抑制-葡萄糖苷酶活性类型上属于混合竞争。.MM和GG两种片段分别随着降解时间的延长，相应的还原糖含量逐渐增加，即平均寡聚度逐渐减小。在清除DPPH自由基和清除O2•方面：三种不同降解时间的MM和GG样品在平均聚合度与清除率之间均存在以下关系：样品平均聚合度降低，清除率反而增强。在清除•OH方面：三种平均寡聚度不同的MM并没有表现出上述关系，但是三种GG样品存在平均寡聚度与清除能力呈反比的关系。