家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的互作及突变研究

家蚕是重要的经济昆虫，对农药的抗性弱，每年都会发生中毒事件，影响蚕丝业健康发展，迫切需要阐明家蚕对农药抗性弱的分子机制。已有的研究表明，乙酰胆碱酯酶基因（ace）相关位点的突变是昆虫产生抗药性的主要机制，家蚕具有两种类型的ace，但两种基因的互作关系、关键位点的突变和抗药性关系，还没有相关的报道。本研究采用RNAi技术，分别对1型和2型进行沉默，研究两种ace的互作；采用定点突变、Bac-to-Bac杆状病毒表达系统和转基因打靶技术，通过对ace相关位点的突变，对突变前后的基因进行体外表达，检测表达产物对底物的敏感性；利用ace的基因组作为同源臂、ace的启动子作为转基因载体的启动子，A3-GFP作为报告基因，构建经突变的ace转基因载体，通过精子介导对家蚕进行转基因研究。通过对转基因个体的筛选、继代，检测后代对有机磷农药的抗性。阐明ace突变和功能的关系，为家蚕的抗药性品种选育打下基础。

本课题测定了5龄第3天家蚕对辛硫磷农药的LC50，检测了添食低浓度辛硫磷农药后不同时间在不同组织中两种乙酰胆碱酯酶基因的转录特征。采用了RNAi方法对家蚕BmN细胞系中ace1和 ace2在进行了沉默，研究了两种基因功能和相互之间的关系。为了研究ace1突变对其抗药性的影响，我们采用定点突变的方法对Ala(GCG)303Ser(TCG), Gly(GGA)329Ala(GCA) 和 Leu (TCT)554Ser(TTC)进行了同时突变。并且通过杆状病毒表达系统分别表达了突变型和野生型两种ace1，SDS-PAGE 和Western blotting分析表明表达蛋白分子量的大小为76 kDa。测定了经过纯化的表达产物的AChE活性和对专一性抑制剂（毒扁豆碱和辛硫磷）的敏感性。结果表明，ace1和 ace2经辛硫磷诱导后在脑、脂肪体和丝腺中呈现先增加后减少的趋势，在24h脑中的ace1和 ace2分别增加了16.22和68.71倍，在脂肪体和丝腺中的增加较少，在中肠中ace1和 ace2的转录水平呈现先减少后增加的特征，结果还表明ace1和 ace2在不同组织的解毒过程中表现不同的特征，推测ace1在脂肪体的解毒过程中发挥重要的作用，而ace2在脑中发挥重要的作用。我们发现ace1被沉默后表达量下降到37.5%时，ace2的表达量增加了66%；当ace2被沉默后表达量下降到33.4%，ace1表达量也下降到原来的26.7%。当ace2被沉默后，其AChE活性下降到原来的86.2%，ace1被沉默后，其AChE活性不变。本研究结果表明，ace2对ace1的表达具有补偿作用，对ace1的表达也具有调控作用，将有助于研究鳞翅目昆虫两种乙酰胆碱酯酶基因的相互关系。定点突变的研究结果表明，突变型和野生型的AChE活性不存在差异，但对专一性抑制剂的敏感性存在差异，即突变后对抑制剂的敏感性降低，表明3个位点的突变对其抗药性有影响，为研究提过AChE突变提高昆虫抗药性奠定了基础。