营养物质和蛋白磷酸化修饰在蜜环菌激发猪苓菌核萌发中作用的研究

Polyporus umbellatus is an endangered medicinal fungus, and its sclerotium is used as medicine. Sclerotium is a highly organized dormant structure that can be dormant without germination for decades, and this is one of the causes of the shortage of natural resources in sclerotia of P. umbellatus. Studies have shown that the co-culture of Armillaria mellea and sclerotia can eliminate quiescent sclerotia, which is a key factor in the germination P. umbellatus sclerotia. Further studies have found that the nutrients supplied by A. mellea and the stimulated protein phosphorylation of P. umbellatus are closely related to the germination of sclerotia. Thus, this study will focus on these two factors to deeply define their roles in sclerotial germination. At first, study the phosphoproteome of P. umbellatus systematically, and obtain the identified and quantified the phosphorylated proteins. Verify those proteins by multiple reactions monitoring method, and then analyze how the signal transfers and regulates sclerotial germination by informatics. And then, Co-cultivate sclerotia with A. mellea fed with stable isotopically labeled glycerol and then identify the nutrient types by GC-MS and LC-HRMS method. Nutrient transport and regulation mechanisms will also be deciphered. The greater insights into the mechanisms of sclerotia germination and the relationship between A. mellea and P. umbellatus can provide certain reference for endangered medicinal fungus cultivation.

猪苓为我国濒危药用真菌，以菌核入药。猪苓菌核是一种高度组织化的休眠结构，可以数十年的休眠而不萌发，这也是造成猪苓自然资源紧缺的原因之一。研究表明，将蜜环菌与猪苓菌核共培养可以解除菌核休眠，蜜环菌是猪苓菌核萌发的关键要素。进一步的研究发现，蜜环菌供给的营养物质以及激发的菌核蛋白磷酸化修饰与猪苓菌核萌发密切相关。为深入研究二者在猪苓菌核萌发中的作用，本研究将开展以下工作：第一，对猪苓菌核开展系统的磷酸化修饰蛋白质组学研究，获得磷酸化修饰蛋白标志物，阐述磷酸化反应是如何将蜜环菌生物刺激传递给菌核并调控猪苓菌核萌发的；第二，以稳定同位素标记甘油的基质培养蜜环菌，再浸染猪苓菌核，建立13C标记物的高分辨GC-MS和LC-HRMS检测方法，明确蜜环菌为猪苓菌核萌发提供的营养物质类型。上述研究不仅深化了猪苓菌核萌发以及菌核-蜜环菌营养关系的认识，也可为解决该药材濒危状况提供理论依据。

猪苓为我国濒危药用真菌，以菌核入药。猪苓菌核是一种高度组织化的休眠结构，可以数十年的休眠而不萌发，这也是造成猪苓自然资源紧缺的原因之一。将蜜环菌与猪苓菌核共培养可以解除菌核休眠，是猪苓菌核萌发的关键要素。为研究蜜环菌激发猪苓菌核萌发的分子基础和供给的营养物质类型，本研究进行相应的研究，结果如下：（1）对猪苓白苓(WS)、灰苓(GS)、未被蜜环菌侵染的菌核(CK)和被侵染的猪苓菌核(MIS)进行了系统的蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白质组学研究，从23185张谱图中共鉴定肽段9379条，鉴定蛋白1429个。二氧化钛磁珠富集磷酸化肽段295条，定性磷酸化修饰蛋白60个（已知蛋白50个，新蛋白10个）。建立了蛋白SWATH定量方法，359个蛋白在MIS与CK间差异表达，获得磷酸化修饰蛋白标志物13个。结果解析表明，蜜环菌侵染猪苓后，致使菌核处于氧化应激状态，进一步的激发了能量和物质代谢，猪苓菌核萌发；此外，一些增强免疫防御的途径被激活（如抗生素类的合成代谢），以进一步抵御蜜环菌的侵染。（2）以2-13C甘油示踪蜜环菌侵染猪苓菌核过程，13C总丰度结果表明，13C在基质、蜜环菌、未被侵染的猪苓菌核和被蜜环菌侵染的猪苓菌核间存在梯度效应，确证了蜜环菌是猪苓菌核萌发及发育的营养供给体。HPLC-MS代谢流检测结果表明，13C经糖酵解途径向氨基酸代谢和脂肪酸合成途径传递，但脂肪酸而非葡萄糖是蜜环菌或猪苓菌核利用或代谢的终产物。上述研究不仅深化了猪苓菌核萌发以及菌核-蜜环菌营养关系的认识，也可为解决该药材濒危状况提供理论依据。本项目已发表研究论文7篇，出版团体标准1项，申请国家发明专利1件，获“培根创新论文奖”一等奖1次，已投稿在审的英文论文2篇。